一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗菌剂及药物制剂或者化妆品领域，具体涉及一种高稳定性的柠檬桉 精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法。
【背景技术】
[0002] 梓檬桉(学名JwcaXrjOto?ci(rioobra，科名：桃金娘科，属名：桉属）原产于澳 大利亚，20世纪20年代中期中国将其引进，目前在广东、广西、四川、云南等省区已有大 量栽培；从柠檬桉叶中提取、纯化出的柠檬桉叶油，主要活性成分为香茅醛，这种精油具 有令人愉快的香味，已在香精、香料、肥皂、化妆品及食品等行业中广泛使用；研究表明柠 檬桉精油中的挥发性成分对植物病原性真菌有抑制效果，其中，香茅醛对金黄色葡萄球菌 ayrei/61)和枯草芽抱杆菌具有比较明显的抑制效 果，利用柠檬桉精油开发天然抗菌剂，对于食品的保鲜具有十分重要的意义。
[0003] 国内外关于柠檬桉的专利申请很少；CN102942461A公开了一种柠檬桉油单离香 茅醛的方法，CN102860303A公开了一种利用柠檬桉叶油提取废液制备蚊子驱避剂的方法， CN101880600A公开了一种提取柠檬桉叶挥发油及3, 8-二醇的方法。
[0004]虽然柠檬桉精油具有较好的抗菌性能，但是柠檬桉精油的提取全部来自纯天然植 物，不添加任何人工合成的防腐剂等，因此其化学成分极其脆弱，并会受到空气、阳光等自 然环境的影响而变质，而且，柠檬桉精油中易挥发物质含量较高，在使用过程中极易挥发， 从而会降低柠檬桉精油的使用率，造成资源浪费，因此有必要寻找有效地方法改善这些问 题。
[0005]本专利发明了一种柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，纳米脂质体是一种由两性 类脂质形成的具有类似生物膜双分子层的微型囊泡，因此，脂质体具有良好的生物相容性， 并且纳米脂质体不会对柠檬桉精油的主要活性成分造成破坏；纳米脂质体能够有效地保护 包裹在内的柠檬桉精油，避免了精油的挥发，而且减少了光对精油的作用，另外，纳米脂质 体具有良好的靶向性，可以靶向到特定的细菌释放被包裹的精油，从而增加精油的杀菌性 能和生物利用性；但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期受限，所以，本专利 选用了壳聚糖和明胶制成稳定性高的多层脂质体，柠檬桉精油多层纳米脂质体的制备有效 地提高了精油的利用率，延长了脂质体的贮藏期。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是公开一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体及其制备方法，通过 将柠檬桉精油包裹在多层纳米脂质体中，以实现减少柠檬桉精油在使用过程中的挥发，从 而减少柠檬桉精油的浪费，达到长效抗菌与高效利用的目的。
[0007]-种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，柠檬桉精油包裹在磷脂双分子层中，其 特征在于：磷脂双分子层为第一层纳米脂质体，还设有第二层纳米脂质体，第二层由壳聚糖 组成。
[0008] 进一步地，所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：还设有第 三层纳米脂质体，第三层由明胶组成。
[0009] 进一步地，第二层纳米脂质体中壳聚糖的浓度为0? 2mg/mL。
[0010] 进一步地，第三层纳米脂质体中明胶的浓度为0. 4mg/mL。
[0011] 大豆卵磷脂、胆固醇是构成脂质体的组要成分，胆固醇均有调节膜流动性的作用， 所以考察其两者的配比变化，对构成的脂质体分散性等参数有无影响；表面活性剂是增加 脂质体稳定性；柠檬桉精油浓度是根据包封率来确定的；醋酸盐溶液的PH是为了最佳溶解 壳聚糖；壳聚糖和明胶都可以增加稳定性。
[0012] 本发明的制备方法是将柠檬桉精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸 干形成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂组成的混合溶液溶解薄膜并超声成乳、离 心后取上层液体过滤得到单层柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：将单层柠檬桉精油纳 米脂质体与壳聚糖溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的双层柠 檬桉精油纳米脂质体。
[0013] 进一步地，将双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶溶液搅拌均匀，通过离心和微孔 滤膜过滤，得到粒径为纳米级的多层柠檬桉精油纳米脂质体。
[0014] 进一步地，本发明的大豆卵磷脂和胆固醇的质量比例为5:1;表面活性剂、柠檬桉 精油与胆固醇的质量比为：1:5:4,此条件下可以得到最高的包封率。
[0015] 进一步地，表面活性剂为PVP，混合溶液中PVP的浓度为L0mg/mL。
[0016] 单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖溶液的体积比为1:10;双层柠檬桉精油纳 米脂质体与明胶溶液的体积比为1:10。
[0017] 本发明中所述的有机溶剂是氯仿。
[0018] 本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液， pH值 3. 5~4. 0。
[0019] 所述的壳聚糖溶液为壳聚糖的醋酸盐溶液，浓度为0.2mg/mL，醋酸盐溶液是根 据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0,优选3. 6,能够最佳溶解壳 聚糖。
[0020] 所述明胶溶液为明胶的醋酸盐溶液，浓度为0. 4mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药 典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0。
[0021] 本发明中脂质体的第一层是磷脂双分子层，即人工细胞膜层。
[0022] 本发明中脂质体的第二层由壳聚糖组成，浓度为0. 2mg/mL。
[0023] 本发明中脂质体的第三层由明胶组成，浓度为0.4mg/mL。
【附图说明】
[0024]图1为柠檬桉精油纳米脂质体的包封率。
[0025]图2为柠檬桉精油纳米脂质体的粒径与多分散系数roi。
[0026]图3为多层柠檬桉精油纳米脂质体荧光显微图。
[0027]图4为多层柠檬桉精油纳米脂质体原子力显微图。
[0028]图5多层柠檬桉精油纳米脂质体对大肠杆菌的抗菌性能。
[0029]图6多层柠檬桉精油纳米脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌性能。
[0030] 表1为柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位。
【具体实施方式】
[0031] 通过下面实例说明本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护内容，不仅局限于此。
[0032] 实施例1多层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率 1实验材料 大豆卵磷脂；BR;国药集团化学试剂有限公司。
[0033] 胆固醇；AR;国药集团化学试剂有限公司。
[0034] 三氯甲烷；AR;国药集团化学试剂有限公司。
[0035] 柠檬桉精油；AR;法国fIorihana精油。
[0036] PVP;GR;国药集团化学试剂有限公司。
[0037] 壳聚糖；BR;国药集团化学试剂有限公司。
[0038] 明胶；BR;国药集团化学试剂有限公司。
[0039] 2实验方法 1)单层柠檬桉精油纳米脂质体的制备 ①称取Ig大豆卵磷脂，0.2g胆固醇和250mg的柠檬桉精油，加50mL氯仿使其溶解。
[0040] ②在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发温度为10~30 °C，圆底烧瓶内壁会形 成光滑的薄膜；然后将所得产品放入真空干燥箱中，30 °C，真空状态下干燥24小时。
[0041] ③称取0.05g的PVP于醋酸盐缓冲液中，超声波条件下扩散，然后将PVP的醋 酸盐缓冲液加入圆底烧瓶中超声波条件下进行水化。
[0042] ④将水化后的混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10s，间隙5s的频率粉碎 30min〇
[0043] ⑤将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体D
[0044] ⑥将所得液体用0.22ym滤膜进行过滤，得滤液，为单层柠檬桉精油纳米脂质 体。
[0045] 2)双层柠檬桉精油纳米脂质体的制备 ①按照上述单层柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，制备含250mg柠檬桉精油的单 层纳米脂质体。
[0046] ②将单层柠檬桉精油纳米脂质体分散在含0. 2mg/mL壳聚糖的醋酸盐溶液中混 合均匀；单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖的醋酸盐溶液的体积比1 :10。
[0047] ③将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10s，间隙5s的频率粉碎30 min〇
[0048] ④将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。
[0049] ⑤将所得液体用0.22ym滤膜进行过滤，得滤液，为双层柠檬桉精油纳米脂质 体。
[0050] 3)多层柠檬桉精油纳米脂质体的制备 ①按照上述双层柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，制备含250mg柠檬桉精油的双 层纳米脂质体。
[0051] ②将双层柠檬桉精油纳米脂质体分散在含0.4mg/mL明胶的醋酸盐溶液中使其 混合均匀；双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶的醋酸盐溶液的体积比为1 :1〇。
[0052] ③将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10s，间隙5s的频率粉碎30 min〇
[0053] ④将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。
[0054] ⑤将所得液体用0.22ym滤膜进行过滤，得滤液，为多层柠檬桉精油纳米脂质 体。
[0055] 4)包封率的测定 用无水乙醇稀释柠檬桉精油，逐级稀释成浓度分别为0.l、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8mg/mL的 标准溶液，然后，分别吸取IyL标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分香茅醛的谱峰面 积进行自动积分，绘制香茅醛峰面积_柠檬桉精油浓度标准曲线；首先取ImL柠檬桉精油纳 米脂质体样品，13500rpm，离心3h，倒掉上清液。接着加入ImL乙醇破乳剂，超声3h，最 后以10000rpm的转速离心15min，取上清液，用于GC-MS分析，制备好的脂质体样品，对精 油主成分的峰面进行自动积分，再根据步骤1中绘制的标准曲线，计算出脂质体中植物精 油的含量。
[0057] 3柠檬桉精油纳米脂质体的包封率 包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通制剂 尚效、低毒等特点的关键；由图1可看出，单层朽1彳冡按精油纳米脂质体的包封率为22. 1%，双 层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率为47. 3%，多层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率最大，为 86. 7%，因此制备多层柠檬桉精油纳米脂质体可以明显提