一种人β-防御素-1在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗病毒药物领域，涉及一种人β -防御素-1 ( β -defensin-1, hBDl)的新用途，更具体涉及一种人β-防御素-1在制备治疗或预防乙型肝炎病毒(ifepatitis Bvirus，HBV)感染药物中的应用。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是引起肝癌的主要因素之一，严重威胁着人类的生命健康。我国是乙型肝炎病毒感染的高发区，约有1.2亿慢性乙肝患者，每年约有30万人死于慢性乙肝引起的肝细胞癌。HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组为部分双链环状DNA。HBV的核心颗粒直径为28nm，为20面体，病毒衣壳由核心蛋白HBc组成。核衣壳的表面有包膜，包膜上含有三种大小的表面抗原preSl，preS2和HBsAg。有感染性的病毒颗粒又称作Dane颗粒，直径为42nm。HBV感染会导致一系列的肝脏疾病，从急性肝炎(包括暴发性肝功能衰竭)到慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。HBV复制本身不直接导致细胞病变，多数的HBV携带者是无症状的，肝损害也很小，宿主的抗病毒免疫是导致肝损伤等临床症状的主要原因。HBV感染人体后的症状与被感染者的年龄和免疫力相关。新生儿中肝炎99%以上是无症状的，1-5岁儿童中，只有10%是有症状的。三分之一的成人急性乙型肝炎患者有临床症状，其中约1%为爆发性肝炎，致死率达到70%。爆发性肝炎伴随着强烈的抗病毒免疫，病毒很快被清除。95%的成年人感染后会自发地清除病毒，而90%的幼儿和30%的1-5岁的儿童则会导致慢性感染。HBV感染和相关疾病的诊断是根据一系列的临床的生化、组织和血清学的指标来进行的。检测病毒感染的指标主要有病毒的几种抗原，和相对应的特异性抗体以及HBV DNA ;检测病人肝脏病变情况主要有血液丙氨酸和谷丙转氨酶(Alanine transaminase, ALT)，以及肝组织检测炎症和纤维化程度。
[0003]目前临床上乙型肝炎病毒感染的治疗主要有两类药物:干扰素和核苷类似物。临床应用的干扰素包括IFNa 2a、IFNa 2b和IFNa lb，这些是传统的干扰素，还包括PEG-1FNa 2a和PEG-1FNa 2b。核苷类似物拉米夫定(Lamivudine, LAM)和替比夫定(telbivudine, LDT);脱氧鸟苷类似物恩替卡韦(Entecavir，ETV);核苷膦酸酯，阿德福韦酉旨(Adefovir, ADV)和富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)。其中ETV, TDF和PEG-1FN最常用。IFN用于治疗慢性HBV感染已经有超过30年的历史。临床上IFN α对于HBeAg阳性的病人，在6个月内，每周注射三次，有25%的病人HBeAg转阴。12个月的IFNa治疗结果显示10-17%的病人HBsAg转阴。对于HbeAb阴性的病人，12个月的IFN α治疗后60%病人血清中检验不到HBV DNA。经PEG修饰的IFN即PEG-1FN，其抗病毒机理与IFNa相同，但明显提高了 IFNa的药物代谢动力学，注射次数为每周一次，血清中IFNa浓度能维持较高的水平。2003年的一项研究表明，PEG-1FN的治疗效果优于IFN。但另一方面，PEG-1FN也有其副作用和局限，若治疗初期的效果不佳，则应停止用药，考虑其他治疗方案。核苷类似物通过抑制HBV RNA的逆转录来抑制HBV的复制。与IFN相比，核苷类似物有一些优势，如副作用小，方便等。但是也有一些缺点，如高复发率，低HBsAg转阴率，单一用药时容易产生耐药性。
[0004]防御素(defensin)是一种抗微生物多妝，包括α-、β-、Θ-防御素，是宿主抵抗入侵病原体的天然免疫反应的组成部分，能抵抗包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，真菌，有包膜和无包膜的病毒在内的各种微生物。人防御素-1 (Human0-defensin-l,hBDl)在多种器官的上皮细胞中组成性表达，有研究表明在克罗恩病中hBDl的组成性表达的缺失可能与PPARy的突变有关，在而在微生物感染和炎症反应中表达量增加，被认为是上皮细胞中最重要的一种抗微生物多肽。hBDl的表达也受表观遗传性调控，HDACl调节hBDl的表达，抑制和siRNA沉默HDACl上调hBDl的表达。hBDl在睾丸上皮细胞，小肠上皮细胞，角膜，星形角质细胞等上皮细胞中均高表达。hBDl在乳腺上皮细胞中高表达，在乳汁中的浓度可达到1-10 μ g/ml，提示hBDl在乳腺抗细菌和新生儿抵抗病原微生物中有重要作用。HBDl在肝细胞里也有较高的表达，有研究显示，hBDl的表达量在HCC中下降，但是暂时没有关于hBDl与HBV的相互关系的研究。对防御素家族成员的抗病毒作用的研究主要集中在α -防御素对HIV、HSV等的作用。HNP1-4的抗HIV作用主要包括，直接使病毒颗粒失活；与gpl20和CD4结合阻止病毒入侵；上调趋化因子MIP-1a和MIP-1 β ;抑制PKC的活性等。关于β-防御素-1对病毒的作用的研究只有其抗HIV活性，其具体机制尚不清楚。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种人β -防御素-1在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，从而为临床上乙型肝炎的治疗提供一类安全高效且毒副作用小的多肽。通过单独使用或者与其他抗HBV药物联合使用，人β-防御素-1能够在预防或者治疗乙型肝炎病毒感染过程中发挥重要作用。
[0006]为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是:
一种人β -防御素-1在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其步骤是: Α、人β -防御素-1抗乙型肝炎病毒活性的评价:
B、将人hBDl的过表达质粒(本实验室构建)或小干扰RNA (广州锐博公司合成)与能表达HBV的质粒pHBVl.3 (D型，构建方法见下文)共转染到肝细胞系IfepG2 (来自ATCC)或Huh7 (来自ATCC)中，随后检测细胞培养上清中HBV分泌抗原HBeAg和HBsAg (上海科华)的表达量和细胞内HBV复制中间体核衣壳相关DNA的水平。
[0007]本实验结果如图1所示。过表达和干扰实验都证明，hBDl能下调细胞培养上清中HBV分泌抗原HBeAg和HBs的表达量和细胞内HBV复制中间体核衣壳相关DNA的水平，说明hBDl抑制HBV复制，具有抗乙型肝炎病毒的活性。
[0008]所述的hBDl的过表达质粒，其构建过程见实施例1。
[0009]所述的质粒pHBVl.3，其构建过程是，提取H印G2.2.15细胞(来自ATCCM^ DNA，扩增 HBV DNA 并插入载体 pBluescript II (购自 Invitrogen)。
[0010]所述的抗乙型肝炎药物是以人β -防御素-1作为药物活性成分，利用常规技术可制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂(活性成分含量5%(质量比，以下相同)，其余为相应辅料(90%淀粉和5% PVP))或注射剂(规格为lmg/mL，溶于生理盐水)任何一种药学上接受的剂型。
[0011]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
1.人β-防御素-1是在人体内组成性表达的一种抗微生物多肽，生理浓度下对人体没有毒副作用。
[0012]2.防御素的抗病毒作用机制是通过直接作用于病毒包膜，或影响病毒吸附，或改变细胞内的信号通路，从而抗病毒，因其抗病毒的机制多样化，不易使病毒产生耐药性。