时后，停止加热，向其中倒入50ml乙醇，10000r/min离心15分钟，获得溶胶状产品，放入-78 0C冰箱，24小时。
[0042]6.从冰箱取出样品，冷冻干燥，冷阱温度_50°C，真空度0.05atm，冷冻干燥3天，获得纤维状干燥物料，即羧基化细菌纤维素，缩写TBC。
[0043]7.将(NH4) ,04和Ca (NO3) 2分别配成0.5M和IM水溶液。同时称取Ig的TBC，将其放入200mL的清水中，用IKA均浆机在25000rmp转速下，分散均匀，获得悬浮液；然后，如图1所示，(NH4)2HPOjP Ca(NO3)2溶液分别装入不同的滴定管中，第一滴定管I中装(NH4)2HPO4溶液，第二滴定管2中装Ca (NO3)2溶液，控制两个滴定管的滴定速度为2ml/min，(NH4)2HPO4和Ca (NO3) 2溶液同时滴入TBC的悬浮液3中，在滴定的同时，TBC悬浮液在磁力搅拌器4上边搅拌边滴定，其搅拌速度为2000rmp，反应温度为室温。同时，在第三滴定管5中装入0.5M的NaOH溶液，向反应液中滴加NaOH，保持体系pH值为10.0。
[0044]需要说明的是，本例采用的是自己制备的羧基化细菌纤维素悬浮液，在一些特定情况下，例如购买的片状或块状的细菌纤维素或羧基化细菌纤维素时，还需要将细菌纤维素或者羧基化细菌纤维素打碎后制成悬浮液。
[0045]8.分别滴定反应I分钟-1小时，获得羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石的重量比，羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石=1:0.25?1:10的改性细菌纤维素，此时改性细菌纤维素仍然以悬浮液形式存在，然后再将反应产物进行真空抽滤，并用清水洗涤3遍，将其装入圆柱形模具中，放入-30度冰箱中，冷冻48小时。需要说明的是，滴定反应的时间，根据(NH4)2HPO4^P Ca(NO3)2的浓度和滴定速度而定，考虑到反应效率，控制滴定反应时间在I分钟-1小时内，可以分别获得重量比羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石=1:0.25?1:10的改性细菌纤维素，本例具体分别制备了 TBC:HA质量比为1:0.25,1:0.5、1: 1、1: 2、1: 5、1:10的改性细菌纤维素用于试验。还需要说明的是，在冰箱中冷冻是为了后续的冻干后获得多孔支架，其中在冰箱冷冻的温度决定了多孔支架的孔径，因此，在本例的深入试验中，优选在-25°C至_30°C温度下冷冻的效果较好，能够获得孔径合适的多孔支架；至于冷冻时间，以将材料完全冻结为止，通常在48-72小时。
[0046]9.将将圆柱形样品放入冻干机中，冷冻干燥，冷阱温度_50°C，真空度0.05atm，冻干3天，得到多孔支架，多孔支架图片如图2所示。
[0047]采用扫描电镜观察本例制备的多孔支架，结果如图3所示，图3为放大5万倍的电镜扫描照片，可见，羟基磷灰石呈球形颗粒附着在羧基化细菌纤维素的纳米纤维上。
[0048]本例将TBC:HA质量比为1:0.25,1:0.5、1: 1、1: 2、1: 5、1:10的改性细菌纤维素，分别制成支架；作为对比，本例还分别采用单纯的TBC和BC制成支架；利用万能力学测试机分别对各支架进行压缩实验，获得杨氏模量数据，将其制成图表，如图4所示，结果显示，BC和TBC制备的支架强度相当，而原位复合HA后，支架的强度降低了很多，但是，弹性增加，具有更好的柔韧性。因此，本例的改性细菌纤维素制备的骨修复支架更适合于除了承重骨以外的骨修复支架。综合考虑，本例制备的重量比羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石=1:0.5-2的改性细菌纤维素适合用于除承重骨以外的骨修复支架；羟基磷灰石含量太低无法达到改性的作用，即体内降解效果不佳，而羟基磷灰石含量太高又不能充分发挥羧基化细菌纤维素的性能。
[0049]另外，本例还分别对纯HA、纯TBC、TBC:HA质量比为1:0.5的改性细菌纤维素以及TBC:HA质量比为1:1的改性细菌纤维素，进行X射线衍射分析，X射线衍射图谱如图5所示。结果显示，纯TBC和纯HA的峰型尖锐，显示较高的结晶度；而复合TBC和HA后，峰型粗糙，为无定形态峰型典型特点，复合材料的结晶度明显降低，而降解都是从高分子的无定形态的结构部分开始的，因此，从理论上分析，复合TBC和HA后，具备了体内降解的可能性。
[0050]动物体内降解试验
[0051]以本例制备的TBC:HA质量比为1:0.5的改性细菌纤维素制备骨修复支架，将该支架植入大鼠大腿内侧，观察植入后不同时期的情况，具体的采用组织切片对植入后的支架进行观察。组织切片染色图如图6所示，图中A为手术后四周的切片图，B为手术后八周的切片图，C为手术后十六周的切片图，三个图中S为植入的骨修复支架。可见，支架植入大鼠大腿内侧4周后，材料周围被结缔组织包围，中间是材料间隙；8周后中间部分也被结缔组织包覆；16周时材料完全给结缔组织包覆，同时体积明显缩小。
[0052]将植入后不同时期的材料取出，洗去包覆在材料上的结缔组织，将支架溶于氢氧化钠，获得澄清溶液，在凝胶色谱中测试材料的分子量，通过分子量得到聚合度；具体的，本例分别测量了植入后I周、4周、6周、8周和16周的支架材料。结果如图7所不，可见，支架材料的聚合度下降，并且，用于试验的改性细菌纤维素支架材料在16周内在大鼠体内的确发生了降解。
[0053]在以上试验的基础上，本例分别对不同的钙源和磷酸根源进行了试验，除可以采用Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4以外，钙源还可以使用CaCl 2，磷酸根源还可以使用Η3Ρ04。此夕卜，对于钙源和磷酸根源的滴定速度，必须要在比较慢的速度下滴定，才能获得更好的反应产物，试验结果显示，滴定速度在0.5-2.5ml/min，所制备的改性细菌纤维素都能够满足使用需求。在滴定时进行搅拌是为了使反应更加充分的进行，试验结果显示，搅拌速度在1500-3500rmp即可。至于反应液的pH值，由于羟基磷灰石必须在碱性条件下才能生成，本例对不同的碱性条件进行了试验，结果显示，反应悬浮液保持在ρΗΙΟ-ρΗΙΙ效果更佳；而调节反应液酸碱性的方法，除可以采用NaOH溶液以外，还可以使用KOH溶液。
[0054]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
【主权项】
1.一种用于骨修复支架的改性细菌纤维素，其特征在于:所述改性细菌纤维素由羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石组成，所述羟基磷灰石与所述羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，羟基磷灰石通过螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上，形成所述改性细菌纤维素。2.根据权利要求1所述的用于骨修复支架的改性细菌纤维素，其特征在于:所述羟基磷灰石原位复合于羧基化细菌纤维素的纳米纤维上；所述羧基化细菌纤维素为C6羧基化的细菌纤维素。3.根据权利要求1或2所述的用于骨修复支架的改性细菌纤维素，其特征在于:所述羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石的重量比为，羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石=1:0.5-2O4.根据权利要求1-3任一项所述的用于骨修复支架的改性细菌纤维素的制备方法，其特征在于:包括将细菌纤维素在无溴体系中进行表面氧化，制成羧基化细菌纤维素，然后再用原位复合的方法，把羟基磷灰石复合在羧基化细菌纤维素的纳米纤维上，获得所述改性细菌纤维素。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于:所述原位复合的方法包括，将所述羧基化细菌纤维素制成悬浮液，然后采用不同的滴定管，同时向悬浮液中滴加可溶性的钙源和磷酸根源，并保持反应悬浮液在PH值大于或等于10的碱性条件下进行反应，生成羟基磷灰石，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，通过该螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述钙源包括但不仅限于Ca(NO 3)2和/或CaCl2,所述磷酸根源包括但不仅限于为(NH4) ,04和/或H 3P04。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述钙源和磷酸根源的滴定速度为0.5-2.5ml/min。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述制备方法还包括，在进行滴定时，边滴定边对反应悬浮液进行搅拌，以使生成的羟基磷灰石均匀的原位复合于羧基化细菌纤维素上，所述搅拌的速度为速1500-3500rmp。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述保持反应悬浮液在PH值大于或等于10的碱性条件，具体为，向悬浮液中滴加碱液，使反应悬浮液保持在ρΗ10-ρΗ11，所述碱液包括但不仅限于NaOH溶液和/或KOH溶液。10.根据权利要求4-9任一项所述的制备方法，其特征在于:还包括，反应结束后，真空抽滤、洗涤，然后将产物装入骨修复支架模具中，在-25°C至-30°C温度下结冻，然后取出样品，在冻干机中冷冻干燥，制成多孔支架。
【专利摘要】本申请公开了一种用于骨修复支架的改性细菌纤维素及其制备方法。本申请的改性细菌纤维素由羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石组成，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，羟基磷灰石通过螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上，形成改性细菌纤维素。本申请的改性细菌纤维素，创造性的采用羧基化细菌纤维素的羧基与羟基磷灰石螯合，通过该螯合键减弱细菌纤维素纳米纤维之间的氢键，降低羧基化细菌纤维素的结晶度，从而使得改性细菌纤维素在体内具备可降解性，为其在骨修复支架中的应用奠定了基础。
【IPC分类】A61L27/58, A61L27/12, A61L27/20
【公开号】CN105031722
【申请号】CN201510508943
【发明人】赖琛, 奚廷斐, 王巧莉, 盛立远, 张志雄
【申请人】北京大学深圳研究院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月18日