[0124] 3)动物和饲养环境：白化豚鼠，普通级，共30只。体重239_279g，动物于普通级动 物房内饲养，动物房的温度为20-24°C，湿度为45-55%RH。饮水为自来水。
[0125] 3.试验方法：采用局部封闭涂皮试验法。
[0126] 1)试验前约24h，将豚鼠背部左侧去毛约6cm2。
[0127] 2)诱导接触：试验0天将原液约0. 2ml涂在豚鼠去毛区皮肤上，以两层纱布和一 层玻璃纸覆盖，再以无刺激性胶布封闭固定6h。试验7天和14天按同样方法重复一次。阴 性对照组动物不作处理，阳性对照组动物用0. 5% 2,4_二硝基氯代苯作同样处理。
[0128] 3)激发接触：在末次诱导后14天，将0. 2ml原液涂于豚鼠右侧约2cmX2cm去毛区 (接触前24h脱毛），然后以两层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激性胶布封闭固定6h。 阴性对照组及阳性对照组动物分别用注射用水及0. 3% 2,4_二硝基氯代苯作同样处理。
[0129] 4)激发接触后24h和48h观察皮肤反应，按《化妆品卫生规范》（2007年版）"皮 肤变态反应试验"中表1进行皮肤反应评分。
[0130] 5)如动物皮肤反应积分多2分时，判为该动物皮肤变态反应阳性，按表3判定受试 物的致敏强度。
[0131] 3、试验结果
[0132] 皮肤营养液对豚鼠皮肤变态反应试验结果表明，最大剂量皮肤营养液未见对豚鼠 皮肤变态反应，见表3。
[0133] 表3.皮肤营养液对豚鼠皮肤变态反应试验结果（BT法）
[0134]
[0135] 注：皮肤反应强度栏中数字为皮肤反应积分为0、1、2、3…时，发生反应的动物数 占受试动物数的比例。
[0136] 结论：受试物（皮肤营养液）对豚鼠皮肤变态反应试验结果为未见皮肤变态反应。
[0137] 实施例皮肤营养液对人脸面部皮肤皱纹的影响
[0138] 1.实验目的
[0139] 皮肤营养液涂抹人脸面部皮肤后，观测其皱纹的变化，以便了解受试物是否具有 抗皱作用。
[0140] 2.实验方法
[0141] 1)采用50-60岁健康人群20个人，10个女性，10个男性。
[0142] 2)在使用皮肤营养液前对其脸面部照相，并用硅胶倒模制作制图。
[0143] 3)使用皮肤营养液12天后照相，同样用硅胶倒模制作制图。
[0144] 4)硅胶倒模制作
[0145](1)、称取20g医用硅胶。加入1ml塑化剂，快速搅拌均匀；
[0146](2)、将搅拌均匀的硅胶涂迅速抹于检测部位，要求涂抹均匀、轻薄；
[0147] (3)、常温下，面部放松、平静30分钟，待硅胶自然凝固；
[0148](4)、小心揭下硅胶倒膜片，倒置于桌面；
[0149] (5)、将一块从皮肤上取下的硅胶皱纹膜片放于平台上，一束倾斜的平行光照在 硅胶皱纹膜片上，有皱纹的地方就会形成皱纹状的阴影。在硅胶膜片的上方有一个高分辨 率的摄像头用于图像拍摄，通过分析这些阴影部分图像灰度值的变化，分析皮肤皱纹的变 化，最终用于抗皱化妆品的检测。
[0150] 5)、皱纹长度和宽度
[0151] (1)、照相机，相机镜头距离皱纹距离：20cm。自动对焦。
[0152] (2)拍摄部位：额头眉心上方皱纹、左眼角皱纹和右眼角皱纹三区。
[0153] (3)以面部斑为对照，通过Photoshop参照比例尺计算皱纹长度、宽度。
[0154] 6)、拍摄倒模照片：每一条件均拍摄3张图片。
[0155] 摄像头聚倒模距离：4cm;摄像头放大倍数：50X。
[0156] 光源：LED补光灯。
[0157]摄像头高度：4. 5cm组，0? 5cm组，14. 5cm组
[0158] 光源距离倒模直线距离：5cm组，15cm组，25cm组。
[0159]7)、图片处理：所有图片均在Photoshop中经灰化，反相处理后保存。
[0160]8)、读取灰度值：以ImageJ软件选取图片区域中，读取并记录灰度值。
[0161] 3?实验结果
[0162] 1)皱纹深度对照组照片灰度见图4?图4显示1mm和2mm模拟皱纹倒模高度，以作 为对照组。通过实验表明，1_和2mm组在相同处理条件下，1mm组灰度组高于2_，可得出 结论，灰度值越高，皱纹倒模纹路越细小。
[0163] 2)使用皮肤营养液前后皮肤照片灰度变化见图5,图5显示，使用皮肤营养液3天 后比使用前的倒模图片灰度值明显增高，并且使用皮肤营养液12天后比使用前的倒模图 片灰度值具有非常显著增高，说明使用后皮肤营养液后皱纹倒模纹路变细小，皱纹明显变 浅。
[0164] 3)使用皮肤营养液后额头皱纹长度变化图，图6显示，使用皮肤营养液3天后比使 用前额头皱纹长度明显缩短，并且使用皮肤营养液12天后比使用前额头皱纹长度具有非 常显著缩短，说明使用后皮肤营养液后皱纹长度明显缩短。
[0165] 4)使用皮肤营养液后额头皱纹宽度变化图，图7显示，使用皮肤营养液3天后比使 用前额头皱纹宽度明显缩窄，并且使用皮肤营养液12天后比使用前额头皱纹宽度具有非 常显著缩窄，说明使用皮肤营养液后皱纹宽度明显缩窄。
[0166] 5)使用前额头皱纹，见图8。使用皮肤营养液12天后额头皱纹明显比使用前减少， 见图9。
[0167] 6)使用前左眼角皱纹，见图10。使用皮肤营养液12天后左眼角皱纹比使用前显 著减少，见图11。
[0168] 7)使用前右眼角皱纹，见图12。使用皮肤营养液12天后右眼角皱纹比使用前显 著减少，见图13。
[0169] 结果，使用皮肤营养液2周后使中老年人脸面部皱纹明显减少，说明皮肤营养液 具有除皱效果。
[0170] 根据上述试验得到结论如下：
[0171] 1.经毒理试验表明，本发明的皮肤营养液多次涂抹动物未见皮肤刺激反应，属于 无刺激性，无皮肤过敏反应，安全无毒。
[0172] 2.上述实验表明，本发明的皮肤营养液有促进体外培养的人皮肤上皮细胞的增殖 作用；皮肤营养液具有抗皱嫩肤作用。
[0173] 此外，本发明皮肤营养液不添加防腐剂、乳化剂、醇醚类、抗氧化剂、激素、稳定剂、 色素、香精等有毒害物质，真正达到有益无害的美容护肤品，安全可靠。
[0174] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1. 一种皮肤营养液，其特征在于该皮肤营养液包括如下组分： 人神经干细胞调节培养液 990 ml， 人重组表皮生长因子 1-100 y g， 抗坏血酸葡萄糖苷 0. 5-5g， 维生素E 0. 2-5g， 维生素原B5 0.3-5g， 神经酰胺 10-lOOOmg， 尿囊素 0. l-3g， 辅酶 QlO l-50mg， 透明质酸， 0. l-4g， 水解胶原蛋白 l-l〇g， 微量元素促渗因子 20-1 OOOmg。2. 根据权利要求1所述的皮肤营养液，其特征在于所述的人神经干细胞调节培养液是 人神经干细胞培养基对人神经干细胞进行培养3-7天，收集得到的上清液，人神经干细胞 培养基是由以下组分混合而成： DMEM/F12 培养基 12g 无菌去离子水 950 mL 肝素钠 200 y g 维生素E 30 y g 人重组胰岛素 25 mg 腐胺 I. 6 mg 亚硒酸钠 6 y g 人转铁蛋白 5. 5 mg 黄体酮 7 y g L 一谷氨酰胺 300mg 4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.9 g 人重组表皮生长因子20 y g 人重组碱性成纤维生长因子20 y g 维生素C葡萄糖苷50mg 庆大霉素 40000 IU。3. -种权利要求1所述的皮肤营养液的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤： 1) 人神经干细胞调节培养液经0. 3 y m滤膜过滤备用； 2) 取尿囊素、抗坏血酸葡萄糖苷、维生素E、维生素原B5、水解胶原蛋白、透明质酸、神 经酰胺、辅酶QlO和微量元素促渗因子，用人神经干细胞调节培养液作为溶剂溶解并充分 混合，得到混合液； 3) 混合液置于56-58°C水浴加温1-1. 5小时，在无菌条件操作配制，最后加入人重组表 皮生长因子，搅拌均匀后灌装，置于_20°C冷冻箱内保存。
【专利摘要】本发明涉及一种皮肤营养液及其制备方法。该皮肤营养液包括如下组分：人神经干细胞调节培养液990？ml，人重组表皮生长因子1-100μg，抗坏血酸葡萄糖苷0.5-5g，维生素E0.2-5g，维生素原B5？0.3-5g，神经酰胺10-1000mg，尿囊素0.1-3g，辅酶Q10？1-50mg，透明质酸0.1-4g，水解胶原蛋白1-10g，微量元素促渗因子20-1000mg。本发明的皮肤营养液可以有效促进皮肤新陈代谢，淡化色斑，平复皱纹，修复受损肌肤，增加皮肤弹性，防止皮肤老化，改善长期使用化妆品后的激素性或其它有害物质引起的敏感皮肤或称问题皮肤，全面改善问题皮肤，嫩化肌肤，达到健康的肤质。
【IPC分类】A61K8/67, A61Q19/02, A61K8/98, A61Q19/08, A61Q19/00
【公开号】CN105055285
【申请号】CN201510531295
【发明人】陈世明, 章瑾, 宣丹英, 毛钟鸣, 江克光, 陈鹏翾
【申请人】浙江奥瑞健生物技术有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月26日