大孔吸附树脂分离纯化辣蓼黄酮的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中草药辣寥总黄酮的分离纯化技术，尤其涉及一种大孔吸附树脂分离 纯化辣寥黄酮的工艺。
【背景技术】
[0002] 辣寥（Polygonum hydropiper Linn.)在我国分布广泛，资源丰富，主要成分为革柔 质、黄酮和挥发油，其中黄酮类化合物有：芦丁、槲皮素、金丝桃苷、山萘酚、异鼠李素。近年 来国内外学者发现黄酮类化合物具有良好的抗菌、抗病毒、抗氧化活性，除此之外，还能降 血压、降血脂，并能提高机体免疫力。
[0003] 近年来，大孔吸附树脂被广泛运用于中草药有效成分的分离及新药的开发与研 制，是一类有机高分子聚合物吸附剂，其具有价格便宜，稳定性高、吸附快，吸附容量大，洗 脱率高，解吸条件温和，再生简便，使用周期长等优点。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简单方便、分离纯化效果好、再生使用 周期长的大孔吸附树脂分离纯化辣寥黄酮的工艺。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：大孔吸附树脂分离纯化辣寥黄 酮的工艺，包括以下步骤：
[0006] (1)利用超声-酶解偶联法对辣寥药材进行总黄酮的提取；
[0007] (2)将步骤（1)获得的提取液依次经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取， 收集乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黄酮，减压蒸干备用；
[0008] (3)将步骤（2)获得的乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黄酮配制成浓度为0. 5~ 1. 5mg/mL的上柱液，通过预处理好的大孔吸附树脂，用60~80%乙醇洗脱4~10倍量柱 体积，洗脱液进行蒸发浓缩，真空干燥，即得纯化辣寥总黄酮。
[0009] 预处理按以下操作进行：取大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24h充分溶胀之后装 柱，用95%乙醇冲洗，收集洗脱液，检查洗脱液无浑浊即可停止收集洗脱液（方法为加入等 体积的去离子水后无浑浊），然后用去离子水洗脱，除去乙醇，；用4倍量柱体积的3%盐酸 溶液冲洗，去离子水冲洗至中性；用4倍量柱体积的3%氢氧化钠溶液冲洗，去离子水冲洗 至中性即可。
[0010] 大孔吸附树脂为弱极性或极性的大孔吸附树脂。
[0011] 大孔吸附树脂为D101、AB-8、DM-130或XDA-8型号。
[0012] 步骤⑴按以下操作进行：
[0013] (1)将辣寥药材干燥、粉碎，分别加入重量为辣寥药材重量0. 2~0. 4%的果胶酶 和纤维素酶，混合均匀，加入pH值为4. 8的HAc-NaAc缓冲液，进行超声-酶解；
[0014] (2)用.0)3溶液调节超声-酶解后的溶液pH值为9. 0,80~90°C水浴10~ 20min使酶失活；
[0015] (3)加入乙醇浸提24h，过滤收集浸提液，滤渣再加入乙醇溶液重复浸提一次，过 滤，合并两次浸提液。
[0016] 超声-酶解温度为30~60°C，时间为1. 0~2. Oh。
[0017] HAc-NaAc缓冲液与辣寥药材的体积质量比为5~50mL : lg。
[0018] 步骤（3)中加入乙醇后，乙醇的终体积浓度为60~80%。
[0019] 为提高有效辣寥黄酮有效成分的含量，发明人建立了一种大孔吸附树脂分离纯化 辣寥黄酮的工艺，该法以超声-酶解偶联法提取的辣寥总黄酮提取液为原料，经多种有机 溶剂萃取后，将乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黄酮利用大孔吸附树脂进一步分离纯化，获 得了纯化辣寥总黄酮。试验表明，本发明的工艺具有成本较低、稳定性高、吸附快、吸附容量 大、洗脱率高、解吸条件温和、再生简便和使用周期长等优点，是一种理想的辣寥总黄酮分 离提纯工艺。
【附图说明】
[0020] 图1是四种大孔吸附树脂对辣寥乙酸乙酯部分黄酮的静态吸附动力学曲线。
[0021] 图2是四种大孔吸附树脂对辣寥正丁醇部分黄酮的静态吸附动力学曲线。
[0022] 图3是上样液浓度对XDA-8大孔吸附树脂辣寥黄酮吸附量的影响。
[0023] 图4是上样液pH值对XDA-8大孔吸附树脂辣寥黄酮吸附量的影响。
[0024] 图5是XDA-8大孔吸附树脂动态累积泄露曲线。
[0025] 图6是总黄酮洗脱曲线。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1辣寥总黄酮的提取
[0027] (1)利用超声-酶解偶联法对辣寥药材进行总黄酮的提取；
[0028] 将辣寥原药粉至100目，按料液比为1 : 30与pH 4. 8的Hac-NaAc缓冲液混合，加 入0. 25%的纤维素酶与果胶酶在50摄氏度下超声1. 5h，之后用Na2C03溶液调pH至9. 0， 在85°C下水浴15min使酶灭活。加入纯乙醇使酶解液中醇浓度为60%，浸提24h，回收浸提 液，滤渣按1 : 30的料液比再加入60%乙醇溶液重复浸提一次，过滤，合并两次的滤液，滤 液经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。收集乙酸乙酯与部分与正丁醇部分，减压 蒸干备用。
[0029] 实施例2大孔吸附树脂对辣寥黄酮的吸附试验
[0030] 大孔吸附树脂的预处理--取各型大孔吸附树脂（D101、AB-8、DM-130和XDA-8型 号）分别用无水乙醇浸泡24h充分溶胀之后装柱，用95%乙醇冲洗，收集洗脱液，检查洗脱 液无浑浊即可停止收集洗脱液（方法为加入等体积的去离子水后无浑浊），然后用去离子 水洗脱，除去乙醇；用4倍量柱体积的3%盐酸溶液冲洗，去离子水冲洗至中性；用4倍量柱 体积的3%氢氧化钠溶液冲洗，去离子水冲洗至中性。
[0031] 静态吸附试验一一将辣寥乙酸乙酯部分黄酮或正丁醇部分黄酮配制成黄酮浓度 为0. 75mg/mL的待上样溶液。将预处理好的大孔吸附树脂抽滤至不滴水，各精密称取2. 0g 放置于100mL具塞锥形瓶中，分别准确加入50mL辣寥乙酸乙酯部分黄酮或正丁醇部分黄 酮，于室温下以120r. min 1的速度在摇床中振摇24h充分吸附后，取上清液用0. 22 y m滤膜 过滤，滤液用分光光度计测定剩余黄酮含量，分别计算各大孔吸附树脂的静态吸附量，结果 见表1。
[0032] 静态解吸试验一一取上述方法中已吸附饱和的树脂，分别加入50mL 95%的乙醇 溶液。在室温下以120r.mii!1的速度在摇床中振摇24h，使大孔吸附树脂解吸完全，取上清 液用0. 22 ym滤膜过滤，滤液用分光光度计测定其中芦丁和黄酮含量的含量，分别计算各 大孔吸附树脂的静态解吸量，结果见表2。
[0033] 静态解吸率的计算将由静态解吸量和静态吸附量之比求得，公式如下：
[0034] 静态吸附量（mg/g) = V药液X (C。、) /M树脂
[0035] 静态解吸量（mg/g) = V洗脱液X C2/M树脂
[0036] 解吸率％ =静态解析量/静态吸附量X 100%
[0037] 其中，C。为黄酮初始浓度（mg/mL)，C :为黄酮剩余浓度（mg/mL)，C 2为洗脱液中黄 酮浓度（mg/mL)，M树脂为树脂质量（g)。
[0038] 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定一一将辣寥乙酸乙酯部分黄酮与正丁 醇部分黄酮配制成黄酮浓度为〇. 75mg/mL的待上样溶液。准确移取辣寥乙酸乙酯部分黄 酮与正丁醇部分黄酮50mL，分别加入盛有4种大孔树脂的锥形瓶内，置恒温振荡器上振荡， 30°C，120r/min，每隔一段时间取lmL溶液测定，连续测定8h，计算树脂对辣寥乙酸乙酯部 分黄酮与正丁醇部分黄酮的吸附率，确定吸附容率与时间的关系，绘制吸附动力学曲线，研 究其吸附速率，结果见图1、图2。
[0039] 表1四种大孔吸附树脂对辣寥黄酮静态吸附量
[0040]
[0043] 表3四种大孔吸附树脂对辣寥黄酮静态解吸率
[0044