758137);胎牛血清（浙江天 杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03 (上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESC0 公司批号：2009/10)penicillinGSodiumSalt(AMRESC0 公司批号：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESC0公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp批号：0793);PBS(实验室自配）；
[0032] 1. 4实验器材
[0033] 莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DM1L);可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD 公司型号：SPECTRA MAX 190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公 司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N 020579);精密移液器（法 国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S);全自动高压灭 菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型 号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号：2001);低速离心 机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0? 2ym滤器（MILLIP0RE型号：SLGP033RB) ;10cm 培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0034] 2实验方法
[0035] 1)小鼠肥大细胞瘤P815细胞用DMEM+10% FBS于37°C、5% C02进行常规培 养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入 311110.25%胰蛋白酶-0.04%￡0了4,37°(：消化21^11后，向其中加入51111完全培养基中和反 应，吹打细胞后将其转入离心管中，l〇〇〇rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 104个/ml。
[0036]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 y 1，培养板放入细胞培养箱 中（37°C，5% C02)常规培养。
[0037] 3)根据细胞生长情况，一般长至50 % -70 %，加入含银杏叶的植物组合物溶液，继 续培养24h。
[0038]4) 24h后加入 20y1 MTT 溶液（5mg/ml，即 0? 5 % MTT)，继续培养 4h。
[0039] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200 y 1二甲基亚砜，置摇 床上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0040] 6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解 介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。
[0041] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示：
[0042] 细胞增值抑制率（％ )=(对照孔0D值-给药孔0D值）/对照孔0D值X 100 %。 实验重复3次。
[0043] 3统计处理
[0044] 采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以 mean iS. D.表不。
[0045] 4实验结果
[0046] MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对小鼠肥大细 胞瘤P815细胞增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)， 当剂量达到15_20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0047] 表1含银杏叶的植物组合物对小鼠肥大细胞瘤P815细胞增殖抑制影响研究 这土 SD)
[0048]
[0049] 注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0050] 5实验结论
[0051] 含银杏叶的植物组合物可以抑制小鼠肥大细胞瘤P815细胞增殖，减少小鼠肥大 细胞瘤P815细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种含银杏叶的植物组合物提取方法，其特征在于植物组合物由银杏叶100份，滇 瓦花50份、独蕨萁40份、山大颜30份、多裂委陵菜50份作为原料药制成，制备方法由下列 步骤组成：取上述原料药，粉碎，加入2L的70 %乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率为400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树 脂柱上，50 %乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取 物，加常规辅料制备成片剂、胶囊或颗粒剂。2. 根据权利要求1所述一种含银杏叶的植物组合物提取方法，其特征在于制备方法中 微波萃取功率为500W，每次萃取6分钟。3. -种含银杏叶的植物组合物在抑制小鼠肥大细胞瘤P815细胞增殖药物中的应用， 其特征在于含银杏叶的植物组合物由银杏叶100份，滇瓦花50份、独蕨萁40份、山大颜30 份、多裂委陵菜50份作为原料药制成，制备方法由下列步骤组成：取上述原料药，粉碎，加 入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率为400-600W，萃取2次，每 次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱 体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，加常规辅料制备成片剂、胶囊或颗 粒剂。4. 根据权利要求3所述一种含银杏叶的植物组合物在抑制小鼠肥大细胞瘤P815细胞 增殖药物中的应用，其特征在于制备方法中所述微波萃取功率为500W，每次萃取6分钟。
【专利摘要】本发明提供一种含银杏叶的植物组合物提取方法，由银杏叶100份，滇瓦花50份、独蕨萁40份、山大颜30份、多裂委陵菜50份作为原料药制成，采用微波提取方法制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了含银杏叶的植物组合物在制备抑制小鼠肥大细胞瘤P815细胞增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/74
【公开号】CN105055587
【申请号】CN201510559302
【发明人】赵明亮
【申请人】南京正亮医药科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月6日