用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的多功能纳米探针的制作方法
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及一种可用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SP1Ns cIusteriPDA多功能纳米探针及其应用。
(二)
【背景技术】
[0002]脂肪干细胞(adiposetissue derived stem cells，ADSCs)是从肝组织中分离的一种间充质干细胞，具有来源充足、体内储备量大、免疫调节功能、适合自体移植等优点，在再生治疗中被当作重要的“种子细胞”；同时，ADSCs具有多向分化性，可定向分化为心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等。因此，ADSCs治疗已经成为一种用于心血管疾病、肝病、骨病、神经系统疾病等重大疾病的新型治疗手段。然而ADSCs治疗多处于临床前研究阶段，其质量可控性、治疗的作用机理等尚待进一步阐述。利用细胞活体示踪技术，研究ADSCs在体内的命运，包括其归巢情况与基本活性(如增殖、分化、凋亡等)等将有助于解决脂肪干细胞治疗的上述难题。
[0003]分子影像学是细胞活体示踪的基本手段，主要包括光学成像、核磁共振成像、核医学成像。其中光学成像的穿透深度较低、无法进行人体或较大动物的成像，无临床应用价值；核医学成像技术需对细胞特异性标志物进行放射性核素标记，但ADSCs特异性标志物的缺乏及其潜在的生物安全性问题决定了该技术无法应用于脂肪干细胞的活体示踪。核磁共振成像(MRI)是目前最常用的细胞活体示踪技术，具有有效成像时间长、可用于临床等优点，可用于动态观察细胞的迀徙过程。
[0004]目前常见的MRI造影剂主要有顺磁性造影剂(T1造影剂)和超顺性造影剂(T2造影剂)。T1造影剂在临床上应用最为广泛的是金属钆配合物，如钆特酸葡胺(Gd-DOTA)，但它在体内清除太快、无特异性分布并且肾毒性较大，导致MRI对比效果不能明显改善。以超顺磁性氧化铁(SP1Ns)为主的T2造影剂以其较长的体内血液循环、优异的体内安全性、成本较低及高灵敏度的特点，已经成为构建新型细胞示踪-MRI造影剂的首选材料。但是目前商业化的T2造影剂多用于临床诊疗，其设计的初衷并不是用于细胞标记与示踪，且这些商业化造影剂仍存在着灵敏度差、磁靶向不强等缺点。
[0005]磁靶向是近年来发展起来的一种新型靶向作用，与基于受体介导的特异性靶向作用相比，这种靶向对具有磁性的纳米粒子靶向性更强，通过外加磁场的引导，可以使纳米粒子快速进入目的区域，操作更加方便。因此，应用具有磁性的纳米粒子标记脂肪干细胞，并通过磁靶向的介导，将有助于增加脂肪干细胞对病损组织的归巢效率，加速疾病的修复进程。
[0006]综上所述，开发一种具有较高灵敏度、磁靶向的T2-MRI造影性能，同时可用于脂肪干细胞的标记、活体示踪与治疗的新型MRI造影剂具有极大的应用前景。
(三)
【发明内容】
[0007]本发明目的是提供一种适用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SP1NsCIusteriPDA多功能纳米探针及其应用。
[0008]本发明采用的技术方案是:
[0009]—种用于脂肪干细胞标记、活体示踪和治疗的SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针，直径为50?lOOnm，由核和包覆在核表面的外壳构成，所述的核为表面包覆有油胺的疏水性纳米四氧化三铁颗粒(SP1Ns)的球形聚集体(SP1Ns cluster)，所述的外壳为聚多巴胺。
[0010]为了提高MRI的灵敏性及T2加权成像功能，本发明利用微乳液法在甲苯/SDS水溶液中将SP1Ns组装成球形聚集体，该种纳米颗粒具有磁靶向功能和高灵敏MRI成像功能。
[0011]为了提高SP1Ns cluster的生物相容性，本发明在SP1Ns cluster表面包覆一层聚多巴胺(PDA)，从而提高了 SP1Ns cluster的生物稳定性，同时降低其毒副作用。
[0012]因此，本发明构建的SP1Ns clusteriPDA纳米颗粒具有磁靶向功能和高灵敏MRI成像功能。
[0013]所述多功能纳米探针由如下方法制得:
[0014](I)以乙酰丙酮铁为铁源，油胺为还原剂，苯醚作为溶剂，通过高分热解法获得表面包覆有油胺的疏水性纳米四氧化三铁颗粒(SP1Ns);具体步骤参考如下:将乙酰丙酮铁溶解于油胺和苯醚的混合溶液中，加热至IlOtC，保温I小时，除去水分。继续升温至300°C，保温2小时，晶化成核，形成四氧化三铁纳米颗粒，加入乙醇作沉淀剂，在2000g离心10分钟后，重复洗涤两次，收集得到SP1Ns，其直径约为10?20nm ；
[0015](2)将表面包覆有油胺的超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒分散在甲苯中，置于超声破碎仪中，逐步滴加SDS水溶液，超声2?3分钟，加热蒸去甲苯，得到所述球形聚集体(SP1Ns cluster);具体步骤参考如下:将表面包覆有油胺的超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒(SP1Ns)分散在1.2mL甲苯中，置于超声破碎仪中逐步滴加0.8mL SDS (0.1M)水溶液，超声3分钟，90°C下加热蒸去甲苯，得到纳米聚集体(SP1Ns cluster)。
[0016](3)将步骤⑵所述球形聚集体分散在多巴胺溶液中，调节pH至8?9，搅拌24?36h后，离心并洗涤2?3次，得到所述多功能纳米探针；其中所述球形聚集体和多巴胺的质量用量之比为:1?3:0.5?I (优选为2:1)。利用多巴胺结构中的邻苯二羟基与铁离子易形成稳定的五元环配合物这一特点，将多巴胺包覆在SP1Nscluster表面，同时多巴胺在碱性溶液中易氧化聚合形成聚多巴胺，利用这种原理可在碱性溶液中在SP1Ns cluster表面包覆聚多巴胺。具体步骤参考如下:配制pH为8.5的Tris缓冲液，将多巴胺盐酸盐溶解于其中，超声下缓慢滴入SP1Ns cluster水溶液，磁力搅拌24小时，后经1000g离心分离，超纯水重复洗涤两次，收集得到SP1Ns clusterOPDA。SP1Ns cluster水溶液中可事先加入SDS，经调整使得反应混合液中SDS终浓度为3?5mmol/L。
[0017]本发明还涉及所述的多功能纳米探针在脂肪干细胞标记与活体示踪的中的应用。具体的，所述多功能纳米探针用于制备脂肪干细胞标记与MRI磁共振活体成像的造影剂。
[0018]本发明还涉及所述的多功能纳米探针在制备磁靶向的脂肪干细胞治疗剂中的应用。
[0019]本发明以具有超顺磁性的纳米四氧化三铁聚集体(SP1Ns cluster)为内核，以独特的设计方案，在SP1Ns cluster表面包覆一层具有生物相容性的聚多巴胺作为外壳，构建得到一种具有高灵敏度，且可用于细胞标记的MRI造影剂。
[0020]本发明所构建的SP1Ns clusteriPDA多功能纳米探针在不影响脂肪干细胞生物学特性的情况下，用于脂肪干细胞的标记，并进一步利用MRI成像对标记后的脂肪干细胞进行活体示踪，所述的SP1Ns clusteriPDA标记浓度为0.25mM。
[0021]本发明所构建的SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针可用于MRI成像活体示踪脂肪干细胞在宿主活体内的生物分布和生存情况，评价脂肪干细胞治疗的疗效；而且由于该纳米探针具有较好的弛豫效率，在磁场的引导下，可用于加速脂肪干细胞归巢至病损区域，加快脂肪干细胞对损伤组织的修复进程；因此该纳米探针不仅可以用于活体示踪脂肪干细胞，而且可用于提高脂肪干细胞治疗效果。
(四)
【附图说明】
[0022]图1为纳米四氧化三铁颗粒(SP1Ns)、纳米四氧化三铁聚集体(SP1Ns cluster)以及表面包覆有PDA的纳米四氧化三铁聚集体(SP1Ns clusteriPDA)的透射电镜图像及晶体衍射图像。A为SP1Ns的透射电镜图像；BSSP1Ns cluster。C表示SP1Ns clusteriPDA多功能纳米探针透射电镜图像；D表示SP1Ns clusteriPDA多功能纳米探针的晶体衍射图。
图 2 为 SP1Ns cluster (- ■-)和 SP1Ns clusteriPDA (― Δ …)的可见近红外吸收光谱。
[0023]图3 为 SP1Ns cluster (.)和 SP1Ns clusteriPDA ( ▲)的磁化曲线和磁滞回线。
[0024]图4 为 SP1Ns cluster (- ■-)和 SP1Ns clusteriPDA (...Δ …)水溶液的温度随光照时间的变化图。
[0025]图5为SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针对脂肪干细胞的细胞毒性。图6为SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针标记脂肪干细胞后的干细胞功能考察实验。A为SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针标记脂肪干细胞的表征实验；B为SP1Ns clusteriPDA多功能纳米探针标记脂肪干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的分化实验。
[0026]图7为脂肪干细胞对SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针的摄取实验。A为脂肪干细胞对SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针摄取的普鲁士蓝染色出为不同时间下脂肪干细胞对SP1Ns clusterOPDA多功能纳米探针的摄取量；C为标记SP1Ns clusteriPDA的脂肪干细胞的体外MRI成像。
[0027]图8为MRI对标记SP1Ns clusteriPDA的脂肪干细胞移植到四氯化碳急性肝损伤小鼠前后的肝脏造影。
[0028]图9为在有无外加磁场引导下的标记SP1Ns clusteriPDA的脂肪干细胞移植到表皮损伤小鼠前后的MRI成像。
(五)
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此: