Necrostatin-1作为中性粒细胞凋亡促进剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新应用，特别涉及Necrostatin-I作为中性粒细胞凋亡促进 剂的应用。
【背景技术】
[0002] 中性粒细胞（polymorphonuclearneutrophil，PMN)是血细胞中寿命最短的一种 细胞，为终末分化细胞，其在红骨髓内分化、成熟，随后释放入血液循环中，在外周血中平均 半衰期为4-10小时，虽然它的生存时间比较短暂，但是在炎症反应中却发挥着非常重要的 作用，一方面它是机体免疫防御系统的第一道防线，另一方面如果它在炎症灶内被过度激 活、延迟清除或继发坏死，可通过释放氧自由基和蛋白水解酶及其它有害内容物加重炎症 反应和周围组织损伤，甚至使炎症迀延和慢性化，从而导致多种疾病产生如类风湿关节炎、 脓毒血症、全身炎症反应综合征、急性冠脉综合征、急性肺损伤等疾病。
[0003] 因而，适时适度清除PMN可控制炎症的发生、发展和转归。PMN凋亡是安全、快速、 非炎性清除PMN的有效途径。凋亡的PMN不仅脱颗粒、吞噬等功能减弱，而且更易被吞噬细 胞识别和清除，摄取了凋亡PMN的吞噬细胞还可分泌转化生长因子(TGF-P)和前列环 素PGE-2等抑炎介质。
[0004]目前研究用于促进中性粒凋亡的药物较少，主要有以下几种。
[0005] 1、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK)抑制剂。研究表明人中性粒细胞表达细胞周期 蛋白激酶⑶K1XDK2和⑶K5,细胞周期蛋白酶抑制剂R_roscovitine、NG7、Hymenialdisine 可通过抑制CDK的活性，促进中性粒细胞凋亡，可用于治疗中性粒细胞凋亡异常的疾病如 急性肺损伤，胸膜炎，关节炎等。
[0006] 2、脂氧素（lipoxins，LXs)，消退素（resolvins，Rvs)。研究表明它们可以通过一 种非炎性的形式阻止和减少中性粒细胞在炎症部位的浸润，促进巨噬细胞对凋亡中心粒细 胞（PMNs)和微生物摄取及清除。
[0007] 3、NF-KB的抑制剂：NF-KB是调控PMN凋亡的重要转录因子，炎症介质致PMN凋 亡延迟与NF-KB的激活有关；研究表明多种NF-KB抑制剂（gliotoxin，SN-50,PDTC)能 够促进中性粒细胞的凋亡。
[0008] 4、死亡受体Fas激动剂：死亡受体Fas激动剂可以通过提高Fas的表达，以及抑制 抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-I蛋白的表达等作用促进中性粒细胞的凋亡。
[0009] 5、IL-10 :研究表明IL-10可以加强小鼠急性肺损伤肺脏中性粒细胞的清除，并可 拮抗LPS对中性粒细胞的凋亡抑制作用。
[0010] 但以上这些药物在推广和应用中有明显的缺陷，细胞周期蛋白依赖性激酶（⑶K) 抑制剂、死亡受体Fas激动剂不仅仅可以诱导中性粒细胞的凋亡，也可以引起其他正常细 胞的凋亡，如何在促进中性粒细胞凋亡的同时而又不影响其他细胞的凋亡很难解决。同样 脂氧素、消退素、NF-kB的抑制剂、IL-10的靶点也比较多参与炎症的多个环节，很难保证 在促进中性粒细胞凋亡的同时而不引起其他副作用，并且合成的价格较高很难应用于临 床。因此开发出一种可以特异性的诱导中性粒细胞凋亡的药物意义重大。
[0011] 5-(1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮（Necrostatin-I)是最 近发现的一种可以特异性的抑制程序性坏死的药物，分子量为259. 3D，属于生物碱类物质。 既往的研究发现它对于凋亡和自噬没有任何抑制作用，不具有直接的抗氧化作用，对于正 常细胞的形态、增殖、黏附以及ATP、钙和氧自由基水平等均无显著影响。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供Necrostatin-I作为中性粒细胞凋亡促进剂的应用。
[0013] 现代医学研究表明，中性粒细胞在炎症反应中却发挥着非常重要的作用，一方面 它是机体免疫防御系统的第一道防线，另一方面如果它在炎症灶内被过度激活、延迟清除 或继发坏死，可加重炎症反应和周围组织损伤而引起多种疾病，适时适度清除中性粒细胞 可控制炎症的发生、发展和转归。中性粒细胞凋亡是安全、快速、非炎性清除PMN的有效途 径。基于上述思想，发明人对化合物5- (1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑 烷酮进行研究，发现5-(lH-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮除公知的抑 制程序性坏死的作用外，还具有促进中性粒细胞凋亡的作用，并可通过促进中性粒细胞的 凋亡来治疗中性粒细胞凋亡异常疾病，特别是LPS引起的急性肺损伤。
[0014] 5- (1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮的分子小，不仅易被机体 吸收，而且可以特异性的作用于中性粒细胞，促进中性粒细胞的凋亡，而对其他细胞的凋亡 无影响。
【附图说明】
[0015] 图1是各组中性粒细胞凋亡率，Annexin-V阳性为凋亡细胞； 图2是各组中性粒细胞凋亡率比较，（n彡3X0. 05/X0. 01与空白组相比）； 图3是与Nec-I共培养的中性粒细胞的凋亡特征性表现，结果显示出现了明显的中性 粒细胞凋亡特征性表现，即中性粒细胞由分叶核到出现和浓缩现象； 图4是中性粒细胞100yMNec-I共培养3h、6h、12h、18h后的中性粒细胞凋亡率检测 结果，##与空白组相比，P〈〇. 05 ; 图5是PBMC与20yM、50yM、100yMNec-I共培养20h后的PBMC凋亡率，与空白组相 比，P> 0? 05 ; 图6是分离后的人中性粒细胞（5X106/ml)分别与Nec-I(IOOyM)、LPS(100ng/ml)、GM-CSF(20ng/ml)、dbcAMP(0.ImM)共培养20h后检测各组中性粒细胞的凋亡情况； 图7是Nec-I对中性粒细胞Bax、Mcl-1、cleavedcaspas-3蛋白表达的影响； 图8 :a:各组小鼠肺泡灌洗液中总细胞数；b:各组小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞数；c:各组小鼠肺泡灌洗液中总蛋白量；d:各组小鼠肺组织中MPO的活力；e:各组小鼠肺组织 干湿重比；ffiP彡0. 01与空白组相比，P彡0. 01与LPS组相比； 图9 :a-c为各组肺泡灌洗液中细胞因子变化情况，d-e为各组肺组织中细胞因子变化， ##P彡0. 01与空白组相比广P彡0. 01与LPS组相比； 图10 :各组肺脏病理改变情况； 图11 :a-b各组小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞的凋亡率；##P< 0. 01与空白组相比， 0.Ol与LPS组相比； 图12 :免疫荧光发检测各组小鼠肺组织中性粒细胞的凋亡情况，采用MPO抗体标记中 性粒细胞，Cleavedcaspase3抗体标记凋亡细胞，MPO与Cleavedcaspase3双阳性为凋亡 中性粒细胞。
【具体实施方式】
[0016] 为了便于描述，以下将化合物5-(1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪 P坐烧酮（Necrostatin-1)简称为Nec-I。
[0017] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0018] 实验一、Nec-I促进人中性粒细胞凋亡 1.实验材料 I. 1中性粒细胞 南方医科大学第三附属医院招募健康志愿者30名，告知志愿者实验内容，签署知情同 意书，伦理方案由南方医科大学伦理委员会审核并通过。抽取志愿者外周血l〇ml，分离中性 粒细胞。
[0019] 受试药物 Nec-I加入DMSO溶解，配制成浓度为lOmg/ml的溶液，经0. 22mm微孔滤膜过滤灭菌处 理后，-20 °C保存待用。
[0020] 主要试剂
2.方法 2. 1中性粒细胞分离 H)TA抗凝采血管收集人外周血IOml;分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液 中（15ml离心管中进行）；注意动作轻柔缓缓加入；500g离心，30-35分钟，室温；离心后收 集低带中性粒细胞，分两层，第一层为PBMC，第二层为中性粒细胞；将RP1640用纯水稀释为 50%RP1640用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性（5-10分钟）；400g离心10分钟，去上清， 收集中性粒细胞，重悬于RP1640中，⑶15磁珠分选获得人中性粒细胞。
[0021] 对中性粒细胞凋亡的影响 分离后的人中性粒细胞（5X106/ml)与不同浓度的Nec-l(20yM、50yM、100yM)共 培养20h后检测各组中性粒细胞的凋亡情况；分离后的人中性粒细胞（5X106/ml)与 Nec-I(100yM)共培养分别于3h，6h，12h和18h检测中性粒细胞凋亡情况；细胞凋亡检测 采用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡。
[0022] 对外周血单个核细胞凋亡的影响 采用人外周血单个核细胞（PBMC)分离液分离获得外周血单个核细胞，分离后的外周 血单个核细胞（5X106/ml)与不同浓度的Nec-I(20yM、50yMUOOyM)共培养20h后检测 各组细胞的凋亡情况。
[0023] 可拮抗多种中性粒细胞凋亡抑制因子的作用 在急性与慢性的炎症过程中，中性粒细胞的凋亡常常会被微生物的产物或者一些 危险因子阻断如LPS、GM-CSF、dbcAMP(dibutyryl-cAMP)，而中性粒细胞的凋亡异常又常 常会导致持续而又不可控制的炎症以及组织的损伤，因此我们检测Nec-I是否可以拮抗 这些因素，使中性粒细胞的凋亡恢复正常。分离后的人中性粒细胞（5X106/ml)分别与 Nec-I(100yM)、LPS(100