白细胞的细胞外诱捕网形成的抑制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以乳铁蛋白作为有效成分的白细胞的细胞外诱捕网形成抑制剂 和用于治疗白细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的组合物。另外，本发明涉及一种使用 所述抑制剂或组合物治疗血细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的方法。
【背景技术】
[0002] NETs(中性粒细胞细胞外诱捕网：neutrophil extracellular traps)为如下细胞 外结构物：由于细菌感染而活化中性粒细胞，分叶核的形态或染色质的分布变得不清楚，接 着核膜消失，染色质结构中混有细胞质或颗粒成分，在细胞膜破裂时放出网状的结构物，捕 获细菌或真菌、寄生虫、病毒，发挥抗菌作用。NETs以DNA为中心，组蛋白3 (H3)或弹性蛋白 酶对其作用发挥重要的作用。NETs形成使有效杀死微生物的抗菌分子集中于局部。由于 产生NETs而中性粒细胞迎来细胞死（NETosis)，但其分子机理不太清楚，通过TNF-a、PMA、 LPS、IL-8等的刺激而产生，此时所产生的细胞死显示出与古典的坏死或由所谓半胱天冬酶 的活化或DNA的片段化所引起的凋亡不同的形态。如果由LPS或PMA刺激中性粒细胞则产 生自噬，同时产生活性氧。由此而产生核膜的裂解、染色质的去解凝、组蛋白的瓜氨酸化，弓丨 起NETosis(非专利文献1和2)。
[0003] 报道称伴随NETs的形成，由于脱颗粒而由中性粒细胞分泌很多蛋白质，尤其是嗜 天青颗粒或第2颗粒中所含的抗菌蛋白质，也分泌与细胞结构相关的蛋白质等（非专利文 献2)。这些蛋白质也称为NETs组分蛋白，报道有中性粒细胞弹性蛋白酶、组蛋白、髓过氧化 物酶、F-肌动蛋白、乳铁蛋白、基质金属蛋白酶9、LL37、组织蛋白酶G、BPI、蛋白酶3、钙卫 蛋白、天青杀素（azurocidin)、溶菌酶C、防卫素、过氧化氢酶等（非专利文献3)。
[0004] 乳铁蛋白包含于中性粒细胞的第2颗粒中，中性粒细胞形成NETs，最终进行脱颗 粒，向周围放出（非专利参考文献1)。
[0005] 乳铁蛋白在哺乳动物中很好保存，其功能未发现很大种类差异。另外，现在作为牛 奶成分的蛋白质其生理活性受到关注并在市场上销售。然而，报道称牛奶对牛的中性粒细 胞的NETs形成未显示出抑制效果（非专利文献4)。
[0006] NETs也与血栓的增大?生长有关，在放出NETs时，其中所含的组蛋白具有解凝血 小板的作用，以NETs为基础形成血小板血栓。而且NETs中所含的中性粒细胞弹性蛋白酶 或组织蛋白酶G分解组织因子途径抑制因子，促进血液凝固反应。由于这些作用而也显示 出使微生物等限制在局部的作用（非专利文献5)。
[0007] 原本NETs的作用是捕捉革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等外来微生物，将其 限制在局部进行杀菌。由于具有这样的作用而在感染症中多被发现，但也有报道称随着感 染症等的慢性化，即使在外来微生物的不存在下也发现NETs的形成。已知作为慢性且难治 性的自身免疫疾病之一的系统性红斑狼疮（SLE)形成针对自身DNA或相关蛋白的自身抗 体，由此在组织或器官中引起炎症。SLE的特征性表现在于中性粒细胞在障碍部位大量存 在。已知在SLE患者的血清中存在抗菌肽LL37和NETs中的DNA(非专利文献6和7)。这 些作为自身抗原被B细胞识别而产生自身抗体。另外，SLE患者的中性粒细胞与正常人的中 性粒细胞相比易引起NETosis (非专利文献6)。认为这些因素会引发慢性炎症。另外，报道 称即使在作为由自身抗体所致的疾病的抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA)相关血管炎中，患 者血清中的IgG级分也比正常人的IgG级分的中性粒细胞的NETs形成能力高约2倍（非 专利文献8和9)。
[0008] 自2004年的Brinkman等人的报道（非专利文献1)以来NETs形成与疾病关联受 到关注，是最近的情况，今后可能会明确由NETs形成所致的新的疾病。由此，NETs形成对 于生物体的感染防御发挥了重要的作用，但也认为根据病情抑制NETs形成对于病情的改 善有时是有必要的。
[0009] 作为抑制NETs形成的物质，报道有，为了分解被放出的DNA网，肺炎链球菌或金黄 色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌的链球菌在菌体外使DNase表达。另外，作为针对组蛋白的 抗体或如抑制超氧化物产生那样的物质报道有二苯基氯化碘盐（DPI)或过氧化氢酶（非专 利文献10)。
[0010] 其他，已知髓过氧化物酶（MPO)活性影响NETosis (非专利文献11)、中性粒细胞 形成NETs并出现细胞死的现象，即NETosis是与凋亡或坏死不同的过程（非专利文献10) 等。
[0011] 虽然有将源自奶的碱性蛋白质组分作为有效成分预防I型糖尿病或风湿性关节 炎的自身免疫疾病的现有技术（专利文献1)，但其为专用于以淋巴细胞为中心的免疫细胞 的调节或炎症性细胞因子的抑制等的内容，并非是涉及抑制NETs形成作用的技术。
[0012] 迄今为止，未报道治疗由NETs形成所引起的疾病的药剂。
[0013] 现有技术文献
[0014] 专利文献
[0015] 专利文献1 :日本特开2008-189637
[0016] 非专利文献
[0017]非专利文献 I :Volker Brinkmann 等，2004Science，303 :1532-1535
[0018]非专利文献 2 :Q Remi jsen 等，2011，Cell Death and Differentiation，18 : 581-588
[0019]非专利文献 3 :Maren von Koeckritz-Blickwede 等，2008，Blood，111 :3070-3080
[0020] 非专利文献 4 :John D. Lippolis 等，2006，Veterinary Immunology and Immunopathology，113 :248-255
[0021] 非专利文献 5 :Fuchs TA 等，2010, Proc Natl Acad Sci USA，107 :15880-15885
[0022] 非专利文献6:63代丨3-1?〇111〇65等，20115(^1'抑1181]^(1，3:73抑20.
[0023]非专利文献 7 :Lande R 等，2011Sci Transl Med，3 :73ral9.
[0024]非专利文献 8 :Kessenbrock K 等，2009, Nat Med，6 :623-625
[0025]非专利文献 9 :Bosch X，2009, J Am Soc N印hrol，8 :1654-1656
[0026]非专利文献 10 :Tobias A. Fuchs 等，2007, J Cell Biol，176 :231-241
[0027]非专利文献 11 :K. Akong-Moore 等，2012, PLOS ONE，7 :e42984
[0028] 非专利文献12 :内藤真等，2010,生物试样分析，33 :329-338
【发明内容】
[0029] 发明要解决的问题
[0030] 本发明的目的在于提供一种由于白细胞的细胞外诱捕网形成而引发的疾病的根 本的治疗药、尤其是适合进行长期的维持缓解（抑制复发）的、安全且有效的治疗药及治疗 方法。
[0031] 本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：乳铁蛋白显著地发挥 NETs形成的抑制效果，可根本地治疗NETs相关疾病。而且可知，在NETs形成疾病的ANCA 相关血管炎模型动物、局部施瓦茨曼反应模型动物和弥散性血管内凝血（DIC))模型动物 中也获得显著的存活率的改善。
[0032] 用于解决问题的方案
[0033] SP，本发明提供以下方案。
[0034] [1]-种白细胞的细胞外诱捕网形成抑制剂，其含有乳铁蛋白。
[0035] [2]根据前述[1]所述的抑制剂，其中乳铁蛋白是以0. 001~10g/kg/日的量的方 式制备的。
[0036] [3]根据前述[1]所述的抑制剂，其中所述乳铁蛋白源自人。
[0037] [4]根据前述[1]所述的抑制剂，其中所述乳铁蛋白为选自由以下（a)~（c)组成 的组中的任一个所述的蛋白质，
[0038] (a)包含序列号1~5中的任一个的氨基酸序列的蛋白质；
[0039] (b)包含在序列号1~5中的任一个的氨基酸序列中的缺失、置换、插入和/或添 加1~66个氨基酸的氨基酸序列，且具有抑制白细胞的细胞外诱捕网形成的活性的蛋白 质；
[0040] (c)具有与序列号1~5中的任一个的氨基酸序列具备90%以上的序列同源性的 氨基酸序列，且具有抑制白细胞的细胞外诱捕网形成的活性的蛋白质。
[0041][5]根据前述[1]~[5]中任一项所述的抑制剂，其中所述白细胞为选自由中性粒 细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的任一个。
[0042][6]根据前述[5]所述的抑制剂，其中所述白细胞为中性粒细胞。
[0043] [7] -种用于治疗白细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的组合物，所述组合物 含有乳铁蛋白。
[0044] [8]根据前述[7]所述的组合物，其中乳铁蛋白是以0. 001~10g/kg/日的量的方 式制备的。
[0045] [9]根据前述[7]所述的组合物，其中所述乳铁蛋白源自人。
[0046] [10]根据前述[7]所述的组合物，其中所述乳铁蛋白为选自由以下（a)~（c)组 成的组中的任一个所述的蛋白质，
[0047] (a)包含序列号1~5中的任一个的氨基酸序列的蛋白质；
[0048] (b)包含在序列号1~5中的任一个的氨基酸序列中的缺失、置换、插入和/或添 加1~66个氨基酸的氨基酸序列，且具有抑制白细胞的细胞外诱捕网形成的活性的蛋白 质；
[0049] (c)具有与序列号1~5中的任一个的氨基酸序列具备90%以上的序列同源性的 氨基酸序列，且具有抑制白细胞的细胞外诱捕网形成的活性的蛋白质。
[0050] [11]根据前述[7]~[10]中任一项所述的组合物，其中所述白细胞为选自由中性 粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的任一 个。
[0051] [12]根据前述[7]~[11]中任一项所述的组合物，其中所述疾病为选自由ANCA 相关血管炎、系统性红斑狼疮、局部施瓦茨曼反应、伴随缺血再灌注损伤的急性肾功能损伤 (AKI)和弥散性血管内凝血组成的组中的任一个。
[0052] [13]根据前述[7]~[12]中任一项所述的组合物，其处于食品的形态。
[0053] [14]根据前述[7]~[12]中任一项所述的组合物，其处于注射剂的形态。
[0054] [15]根据前述[7]~[13]中任一项所述的组合物，其为口服给与。
[0055] [16] -种白细胞的细胞外诱捕网形成的抑制方法，其包括向患者给与乳铁蛋白。
[0056] [17] -种白细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的治疗方法，其包括向患者给与 乳铁蛋白。
[0057] 发明的效果
[0058] 本发明可提供针对于由白细胞的细胞外诱捕网形成所引起的疾病的副作用少的 治疗方法。另外，由于副作用少，所以具有可安心用于较广范围的患者和潜在患者人群的优 点。
[0059] 本发明的抑制剂和组合物可广泛用于高龄者、患癌患者等免疫力降低的受试者、 感染症合併症例、有肺结核病史的受试者等较广泛的受试者人群。另外，提供即使长期使用 其副作用也少的、与白细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的治疗药和治疗方法。尤其是 在治疗所述疾病中需要长期使用药剂的情况下，作为急性期症状缓解后的受试者的复发抑 制剂、以及作为所述疾病慢性化后的治疗药是有用的。
【附图说明】
[0060] 图I-A是表不基于牛乳铁蛋白的NETs形成抑制能力的图。
[0061] 图I-B是表示基于人乳铁蛋白的NETs形成抑制能力的图。
[0062] 图I-C是表示人乳铁蛋白抑制NETs形成的状态的荧光显微镜照片。
[0063] 图I-D是表示由人乳铁蛋白抑制伴随NETs的DNA放出的效果的图。
[0064] 图I-E是表示由人乳铁蛋白抑制伴随NETs的DNA放出的状态的电子显微镜照片。
[0065] 图2是表示由人乳铁蛋白抑制伴随NETs的DNA放出的效果的图。
[0066] 图3是表示通过牛乳铁蛋白的口服给与而使ANCA相关血管炎模型动物的存活率 上升的效果的图。
[0067] 图4-A是表示通过牛乳铁蛋白的口服给与而使ANCA相关血管炎模型动物的血中 MPO-ANCA抗体效价降低的效果的图。
[0068] 图4-B是表示通过牛