0171] 表4:牛至提取物1和氟西汀在弹子埋藏测试中在小鼠中的作用
[0172]
[0173] 每组15只小鼠
[0174] Student' s t检验：NS=不显著；* =p<0? 05 ;*** =p<0? 001
[0175] 较之载剂对照而言，在测试前30分钟腹膜内施用的牛至提取物1 (10、30和60mg/ kg)剂量依赖性地减少了覆盖的弹子的数量（分别是-40%，p< 0. 05, -73%，p< 0. 001 和-67%，p< 0? 001)。
[0176] 较之载剂对照而言，在相同实验条件下施用的氟西汀（32mg/kg，腹膜内施用） 和文拉法辛（16mg/kg，腹膜内施用）使得弹子埋藏近乎消失（分别为-93%和-98%，p < 0? 001)〇
[0177] 这些结果表明，在显著降低焦虑/强制-强迫行为的能力方面，牛至提取物1具有 与SSRI(氟西汀）和SNRI(文拉法辛）相近的效用。
[0178] 实施例10 :在光照黑暗盒测试中牛至提取物1在小鼠中的作用
[0179] 用于检测抗焦虑药活性的本方法按照Crawley，1981 Pharmacol. Biochem. Behav.，15 :695-699所述来进行。抗焦虑药增加了光照区室中消磨的时间。
[0180] 动物被放进2区室盒中的光照区室，该盒一半是有光照的敞开的 (25X27X27cm)，另一半是黑暗并密闭的（20X27X27cm)。在3分钟的测试中，对在每个区 室中消磨的时间以及动物从一侧穿到另一侧的次数进行计分。每组研究15只小鼠。测试 以盲法进行。
[0181]在测试前30分钟，腹膜内施用3个剂量的牛至提取物1 (10、30和60mg/kg)，对其 进行评估，将其与载剂对照组相比。将牛至提取物1溶解于含有3% (v/v)DMS0和3% (v/ v)Tween? 80的盐水溶液（"载剂"）中。向对照组施用载齐I」，文拉法辛（16mg/kg，腹膜 内施用）用作为比较物质，氯巴占（clobazam) (16mg/kg，腹膜内施用）用作为参照物质，所 有都在测试前30分钟腹膜内施用。
[0182] 表5 :小鼠中光照黑暗盒测试的结果
[0183]
[0185] 较之载剂对照，牛至提取物1在10和60mg/kg时增加了在光照区室消磨的时间 (分别为+28%和+35%4 = 0.0506，接近于显著）。其在1011^/1^时趋向于增加穿越的次 数（+51%，p= 0. 0888)，但在30和60mg/kg时没有明显的作用。因此如在光照-黑暗盒 测试中在小鼠中测量的那样，可以假定牛至提取物1具有中等抗焦虑作用。
[0186]实施例11 :亚慢件口服填饲后，牛至提取物4在Porsolt's强迫游泳测试中在小 鼠中的作用
[0187] 该测试检测抗抑郁活性，这按照实施例7中所述来进行，但化合物的施用途径和 剂量有所不同。在测试前24、5和1小时口服（p. 〇.)施用3种剂量（75、150和300mg/kg) 的牛至提取物4,对其进行评估，将其与载剂对照组相比。这样施用的牛至提取物1被溶解 于去除生育酚的玉米油（"载剂"）中。在测试前24、5和1小时，向对照组施用载剂（p. 〇.)， 而向一个单独的组施用作为参照化合物的丙咪嗪（32mg/kg，p. 〇.;溶解于水中）。
[0188] 小鼠被各自放进含13. 5cm水（22°C)的圆筒（高度=24. 5cm，直径=19.5cm)中， 它们无法从中逃离。小鼠被放进水中6分钟，通过视频相机自动观察，通过可商业获得的软 件系统（VideoMot2，TSESystemsGmbH，Germany)进行监测，测量最后4分钟期间无法移动 的持续时间。
[0189] 五个组中的每组研究10只小鼠。使用方差分析（AnalysisofVariance，ANOVA) 和Bonferronipost-hoc检验，比较处理组和阳性对照组，对数据加以分析。
[0190] 表6 :亚慢性施用三种浓度的牛至提取物1之后小鼠中进行的强迫游泳测试的结 果
[0191]
[0192] 每组10只小鼠
[0193]Student'st检验：NS=不显著；* =p< 0? 05 ;*** =p< 0? 001
[0194] 因此，较之对照组，牛至提取物4显著降低了无法移动的时间，低剂量组和中等剂 量组中分别降低了 41%和32%。总体而言，牛至提取物4具有显著作用。较之载剂对照 在相同实验条件下施用的丙咪嗪（32mg/kg，i.p.)显著降低了无法移动的行为（-50%，p < 0? 001) 〇
[0195] 这些结果显示，牛至提取物4(75和150mg/kg，p.o.)在显著降低抑郁相关行为的 能力方面具有与三环类抗抑郁剂（丙咪嗪）相近的效用。
[0196]实施例12 :通讨体内微滲析测量的牛至提取物4对海马趾5-羟色胺水平的作用
[0197] 在受控温度（21±2°C)和湿度（55±10 % )下，将雄性Sprague-Dawley大鼠 (250-320g)分为4-5个的组来养育，它们可自由获取食物和水（07. 00-19. 00光照）。使 用水合三氯乙醛（400mg/kgi.p.)来麻醉大鼠，在下述坐标（从前囱和硬脑脊膜表面， rostro-尾位-4. 5mm;侧位-2. 5mm;背腹位-4. 5mm)使用立体定位框将单微渗析探针（BASi 型MD2200, 2mm的膜，30, 000道尔顿的分离点）植入脊背海马，用牙科粘固粉将其固定。使 用加热垫将体温保持为36°C，通过数字式直肠温度计进行监测。用人工脑脊髓液（aCSF) 以1y1/分钟对微渗析探针进行灌注，每15分钟通过收集灌注液样品来测定细胞外单胺水 平，使用具有电化学检测的高效液相色谱（HPLC)来进行检验。
[0198] HPLC移动相（0? 5mMEDTA、0. 1M单氯乙酸pH3. 1、0. 15g/L辛基磺酸钠、5%乙腈、 〇? 7%四氢呋喃）以70y1/分钟栗经系统。使用反相1X100mmODS3mm微柱（具有5y1 的注射环）来分离单胺，并用具有玻璃状碳电极（设置为+650mV)对Ag/AgCl参照电极的 Epsilon电化学检测仪（BASi)加以检测。通过将峰洗脱时间与参照标准相比较，来确定渗 析液的峰，使用线性回归分析，根据对峰面积的测量来加以定量。对于5HT和5HIAA的检测 极限被定义为每单位时间产生背景噪音两倍的峰面积的样品量，在两种情况下其都为大约 0.lfmol/样品。
[0199] 初级研究证实，渗析探针植入之后，由于手术导致的凝血激活的血小板释放，5HT 水平最初较高，但在手术完成150分钟内，基线5HT水平接近恒定。因此手术后150、210和 270分钟时常规施用注射，收集灌注液样品，直到最后一次注射后60分钟。
[0200] 对于常规检验而言，准备两只大鼠，其中一只用于测试牛至提取物，另一只用于对 照（载剂）样品。因为检验间5HT的基线释放的可变性以及微渗析探针用于检测细胞外液 体中5HT的效率的可变性，根据第一次注射前即刻获得的两个值（即，135和150分钟的时 间点的样品）来对这些数据进行归一化。因此，对于每种化合物而言，来自重复研究的样品 被表示为％基线水平，这与微渗析研究中通常的实践做法一样。为了测定每种剂量的提取 物对于释放的5HT总量的作用，每种剂量施用后，使用梯形方法在取样期间估计曲线下面 积（AUC)，通过2-因素ANOVA(检验因子是处理和剂量）将测试化合物/提取物的值与合适 的对照相比较，接着使用Bonferronit检验在各剂量处进行post-hoc比较。使用Graphpad Prism进行所有统计分析。
[0201] 将牛至提取物4(10、30和60mg/kg，i.p.)溶解于含有0? 2% (w/v)轻丙甲基纤维 素的盐水中，而参照化合物，氟西汀（3、10和30mg/kg，i.p.)溶解于盐水中。额外研究两个 对照组，它们分别被施用含有0.2% (w/v)羟丙甲基纤维素的盐水或仅盐水。
[0202] 表7 :牛至提取物1对每次给剂量期间累积的5HT的影响，其相对再首次给化合物 剂量前即刻测量的基线5HT水平来表示。注射在手术后150、210和270分钟时进行。每种 化合物的剂量被表示为mg/kg。数据被表示为均值土s.e.m.(n= 5-6)。使用Bonferroni t检验以及针对每种化合物总体的情况通过两因素AN0VA，将针对每种化合物剂量的统计 学分析与针对合适载剂（盐水或盐水+0.2%羟丙甲基纤维素）的相应时期相比比较。
[0203]
[0204] 通过2-因素AN0VA分析的对在施用每种剂量的处理之后60分钟内作为AUC测量 的累积5HT释放的评估也显示了用牛至提取物4进行的处理的显著总体效果（F(l，30)= 5. 61;p< 0? 05) 〇
[0205]实施例13 :牛至提取物1的多巴胺摄取抑制
[0206] 若干神经递质（包括多巴胺）的作用是通过质膜转运蛋白从突触连接对它们的快 速摄取和清除来调控的。中枢多巴胺能神经元中的多巴胺转运蛋白负责释放的神经递质中 多至90%的回收。单胺转运蛋白是多种精神活性试剂（例如可卡因、安非他明和抗抑郁剂） 的高度亲和靶。这些试剂通过阻断转运蛋白以及随后防止神经元摄取，来升高中枢和外周 神经系统中细胞外神经递质的浓度，由此作用于其行为和自主作用。
[0207] 检验前将表达人多巴胺转运蛋白（hDAT)的CH〇-Ki/hDAT细胞涂板。将细胞 (2xl05/ml)与牛至提取物和/或载剂一起在经改良的Tris-HEPS缓冲液（pH7. 1)中 于25°C孵育20分钟，之后加入50nM的[3H]多巴胺10分钟。在存在10yM诺米芬新 (nomifensine)的情况下测定特异性信号。然后用1 %SDS裂解缓冲液来溶解细胞。相对 于载剂对照而言[3H]多巴胺摄取50%或更多（彡50% )的降低显示了显著的抑制活性。 在最高达100yM的10个浓度下筛选纯的化合物（诺米芬新百里氢醌）：0. 00316、0. 01、 0.0316、0.1、0.316、1、3.16、10、31.6和100 1^。在最高达100 1^/1111的10个浓度下筛选 牛至提取物：0.00316、0.01、0.0316、0.1、0.316、1、3.16、10、31.6和100 1^/1111。这些相同 的浓度被同时应用于未受处理的细胞的单独的组，并且只有在观察到了对摄取的显著抑制 的情况下，针对可能的由化合物诱导的细胞毒性来进行评估。
[0208] 表8 :测量到的牛至提取物1及其挥发性组分百里醌抑制多巴胺被再摄取进经转 染CH〇-Ki细胞的IC5。值。数据以均值土s.e.m.显示，其中IC5。针对单种化合物示为yM(或 nM)，针对牛至提取物示为yg/ml。
[0209]
[0210]
[0211] *表示所用的标准参照试剂。
[0212] 参考文献：
[0213]Giros,etal. 1992Mol.Pharmacol. 42 ：383~390
[0214]Pristupa,etal1994Mol.Pharmacol. 45 ： 125-135
[0215]实施例14:牛至提取物的去甲肾h.腺素摄取抑制
[0216] 若干神经递质（包括去甲肾上腺素）的作用是通过质膜转运蛋白从突触连接对它 们的快速摄取和清除来调控的。中枢去甲肾上腺素能神经元中的去甲肾上腺素转运蛋白负 责释放的神经递质中多至90%的回收。单胺转运蛋白是多种精神活性试剂（例如可卡因、 安非他明和抗抑郁剂）的高度亲和靶。这些试剂通过阻断转运蛋白以及随后防止神经元摄 取，来升高中枢和外周神经系统中细胞外神经递质的浓度，由此作用于其行为和自主作用。
[0217] 检验前将稳定表达人去甲肾上腺素转运蛋白的狗肾MDCK细胞涂板。将细胞 (2xl05/ml)与牛至提取物和/或载剂一起在经改良的Tris-HEPS缓冲液（pH7. 1)中于 25°C孵育20分钟，之后加入25nM的[3H]去甲肾上腺素孵育10分钟。然后对孔中的细胞漂 洗两次，用1%SDS裂解缓冲液来溶解细胞，对裂解产物进行计数，来测定[3H]去甲肾上腺 素摄取。在存在10yM去甲丙咪嗪的情况下测定特异性信号。相对于载剂对照而言[3H]去 甲肾上腺素摄取50%或更多（彡50%)的降低显示了显著的抑制活性。在最高达100yM的 10个浓度下筛选