具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于壳聚糖微颗粒领域，特别涉及一种具有血红细胞形状和大小的壳聚糖 微颗粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 传统的聚合物微颗粒主要呈球形，然而非球形的聚合物微颗粒，特别是血红细 胞形状的聚合物微颗粒在生物医学和生物化学领域应用时更具优势。相对于球形的聚 合物微颗粒，非球形的聚合物微颗粒更不容易被巨细胞吞内化（Pharmaceutical Research. 2009, 26(1) ,244)，比微球甚至是纳米球都有更好的革巴向效果（Journal of Controlled Release. 2007, 121 (1)，3)，够避免被脾脏过滤，从而延长其在体内的半衰 期（Nature Materials. 2009, 8(1)，15)。具有血红细胞形状的微颗粒可代替血红细胞用 于血细胞分析仪或流式细胞仪等仪器的校准，避免由形状差异引起的仪器校准误差，所 述微颗粒还有望应用于再生医学领域，为人工合成材料与生物实体之间建立良好的桥梁 (Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009, 106(51), 21495)〇
[0003] 目前，主要通过种子-模板法、溶剂交换法和溶剂挥发法制备具有血红细胞形状 的聚合物微颗粒。Wang L等将PES和聚乙二醇（PEG)溶解于二甲基亚砜中形成喷射液，以水 为接收液，采用静电喷射技术制备出了具有血红细胞形状的PES微球（Journal of Applied Polymer Science. 2011，122(4)，2552)。该方法中，当喷射液滴进入接收液后，PEG的强烈 吸水作用使得溶剂与非溶剂的交换速度加快，喷射液滴内的PES会快速地在喷射液滴界面 附近沉淀出来，导致喷射液滴内部出现大孔洞，造成微球固化后的械强度降低，在干燥过程 中孔洞处凹陷即形成具有血红细胞形状的PES微球。该方法无法确保微球在干燥过程中凹 陷程度一致，存在着微球的凹陷程度不可控的问题，且该方法制备的微球的单分散性较差， 尺寸差异大、粒径分布范围较宽，为7~15 ym。而在实际应用中，微球或微颗粒的形状和大 小的均一程度对用药效果、药物靶向性以及作为标准品使用的准确性都有重要影响。
[0004] 由于壳聚糖具有独特的生物活性、生物相容性好和易降解等特点，在生物医学、生 物化学等领域具有良好的应用前景，目前已有大小与血红细胞相当的球形壳聚糖颗粒的报 道（CN104792688A)，但尚无形状和大小均与血红细胞相当的壳聚糖微颗粒的报道，若能制 备出凹陷程度一致性高和尺寸均一性良好的具有血红细胞形状的壳聚糖微颗粒，对于提高 壳聚糖微颗粒的使用价值，拓展其在生物医药学和生物化学等领域应用具有重要是意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有血红细胞形状和大小的壳 聚糖微颗粒及其制备方法，以丰富功能型壳聚糖微颗粒的种类，提高微颗粒形状和尺寸的 均一性。
[0006] 本发明提供了一种具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒，该微颗粒由壳聚 糖与对苯二甲醛经交联反应形成，微颗粒呈一面凹陷的扁平圆盘状，圆盘的直径为8~ 10 y m，微颗粒的变异系数值为5~7 %。
[0007] 上述具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒在酸性条件下能够溶解，其在酸性 条件下溶解的原理如式（1)所示，在中性介质中，壳聚糖的氨基与对苯二甲醛的醛基反应 生成希夫碱，因此在中性条件下，壳聚糖微颗粒能保持其结构的完整性；在低pH值的酸性 介质中，壳聚糖由于氨基质子化而带正电，分子间的静电斥力和亲水性增强，壳聚糖微颗粒 急剧溶胀，随着壳聚糖氨基的不断质子化，壳聚糖与对苯二甲醛交联反应形成的希夫碱逐 渐变得不稳定，最终导致壳聚糖微颗粒解体而溶解。
[0008]
[0009] 本发明还提供了一种具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒的制备方法，工艺 步骤如下：
[0010] ⑴喷射液和接收液的配制
[0011] 喷射液的配制：将水溶性壳聚糖和水溶性表面活性剂溶解在水中形成溶液，然后 向溶液中加入扩散非溶剂和挥发性非溶剂并混合均匀得到混合液，用氢氧化钠水溶液调节 混合液的pH值至6. 3~6. 4,将调节pH值后的混合液离心、过滤，即得喷射液；所述混合液 中，水溶性壳聚糖的质量分数为2%~3%，水溶性表面活性剂的质量分数为1%~2%，扩 散非溶剂的体积分数为30 %~40 %，挥发性非溶剂的体积分数为20 %~25 % ;
[0012] 接收液的配制：将聚蓖麻酸甘油酯、四甲基乙二胺与溶剂混合均匀，然后加入对苯 二甲醛，搅拌至对苯二甲醛完全溶解即形成接收液；所述溶剂为正己醇、甲苯和正辛烷的混 合液，正己醇、甲苯、正辛烷的体积比为1: (1~2) : 2,聚蓖麻酸甘油酯的量为每lmL溶剂中 0. 04~0. 08g，四甲基乙二胺与溶剂的体积比为（0. 004~0. 008) : 1，对苯二甲醛的量为每 lmL 溶剂中 0? 0005 ~0? 005g ;
[0013] (2)壳聚糖微颗粒的制备
[0014] 在空气湿度为16 %~20%、温度为40~45°C的恒温环境中，将与恒温环境温度相 同的喷射液加入静电纺丝设备的注射器中，然后由注射栗推入金属针头，在金属针头处施 加高压静电，喷射液即形成喷射液滴，采用盛有接收液的容器在搅拌条件下接收喷射液滴， 所述喷射液滴从金属针头喷射出来到进入接收液的过程中，经历溶剂挥发、溶剂扩散以及 壳聚糖与对苯二甲醛的交联反应，待喷射液滴中的壳聚糖与接收液中的对苯二甲醛完全交 联即形成具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒；控制施加在金属针头处的电压为5~ 7kV，喷射距离为5~8cm，金属针头的内径为104~130 y m，喷射液的流量为100~130 y L/ h；
[0015] ⑶洗涤
[0016] 采用异丙醇洗涤步骤（2)所得壳聚糖微颗粒以除去微颗粒表面的接收液，然后用 水洗涤除去异丙醇。
[0017] 上述方法中，所述扩散非溶剂为二甲基亚砜。
[0018] 上述方法中，所述挥发性非溶剂为乙醇。
[0019] 上述方法中，所述水溶性表面活性剂为Pluronic F127〇
[0020] 上述方法中的步骤（2)中，对接收液进行搅拌是为了避免先喷射出的喷射液滴在 接收液表面与后喷射出的喷射液滴合并，以及避免接收液中正在发生交联反应的微颗粒之 间相互粘连，优选采用200~300rpm的转速对接收液进行搅拌。
[0021] 上述方法中，所述水溶性壳聚糖的重均分子量< 5000。
[0022] 上述方法中，所述氢氧化钠水溶液的浓度至少为lmol/L。
[0023] 上述方法中，所述水为去离子水或蒸馏水。
[0024] 本发明所述具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒的形成机理如图2所示，图 2中的匕~b 6对应于图1中的b :~b 6六个阶段。向壳聚糖水溶液中加入扩散非溶剂二甲 基亚砜（DMS0)和挥发性非溶剂乙醇形成喷射液，喷射液在静电场力的作用下形成喷射液 滴后（见图2bi)，乙醇会从喷射液滴的内部到达喷射液滴的表面并挥发（见图2b 2)，由于乙 醇的挥发会使得喷射液滴的温度降低，从而使DMS0与壳聚糖发生相分离，随着乙醇到达喷 射液滴的表面（见图2b 3)，壳聚糖分子则向喷射液滴的内部运动，这不仅能避免由于乙醇挥 发使得壳聚糖在喷射液滴表面的浓度增加而使微颗粒表面出现褶皱的现象，还有利于喷射 液滴进入接收液后DMS0向接收液扩散。当喷射液滴到达接收液的液面后，如图2b 4所示， 分散在喷射液滴表面的DMS0由于能与油相接收液互溶而迅速地向喷射液滴接触到接收液 的地方扩散，壳聚糖分子则向喷射液滴的另一端移动。如图2b 5所示，喷射液滴进入油相接 收液后，形成油包水（W/0)型乳液，集中在乳液一端的DMS0会向接收液中扩散，同时，接收 液中的对苯二甲醛会与喷射液滴另一端的壳聚糖发生交联反应使其固化。随着DMS0的扩 散，DMS0 -端的少量壳聚糖水溶液会向内凹陷并通过与对苯二甲醛发生交联反应固化并维 持这种凹陷状态，形成如图2136所示的具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026] 1、本发明提供了一种新型的壳聚糖微颗粒，该微颗粒呈一面凹陷的扁平圆盘状， 圆盘的直径为8~10 ym，该微颗粒的形状和大小与血红细胞相当，由于该形状的壳聚糖微 颗粒具有在体内不易被巨噬细胞吞噬内化、能避免被脾脏过滤、半衰期长和靶向性好等特 点，因而更加符合生物医药学、生物化学等领域的特殊需求，尤其适合用于包封药物或显像 剂在药物传送或医学成像领域应用。
[0027] 2、本发明所述具有血红细胞形状和大小的壳聚糖微颗粒的变异系数值仅为5~ 7%，其尺寸均一性好、凹陷程度的一致性高，与真实血红细胞的形态接近程度高，将其替代 真实的血红细胞作为校准血细胞分析仪的标准品使用时，由于其与真实血红细胞的形态非 常接近，且颗粒的单分散性良好，因而能够避免因微颗粒与真实血红细胞的形状差异引起 的仪器校准误差，提高血细胞分析仪校准和分析的准确性。
[0028]3、由于本发明所述壳聚糖微颗粒由壳聚糖与对苯二甲醛通过交联反应形成，壳聚 糖与对苯二甲醛之间的交联反应是可逆的，该壳聚糖微球在中性环境中能保持结构的完整 性，在酸性环境中能迅速溶解，因此，将所述壳聚糖微颗粒作为血细胞分析仪器校准用标准 品使用后，通过向仪器中加入酸即可将残留