一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表 位疫苗及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp)的感染呈全球分布，它与慢性胃炎、消 化性胃溃疡、胃癌和胃黏膜相关组织淋巴瘤（MALT)等胃部疾病相关，被世界卫生组织归为 I类致癌因子。在不同国家之间和同一国家不同地区之间，甚至不同民族之间，Hp感染率存 在明显差异，在发达国家Hp感染率为30 % -50 %，我国属于世界上感染率较高的地区，感染 率高达58. 07%，且呈现明显的家庭聚集现象。目前Hp感染的治疗主要基于抗生素药物疗 法，虽然在临床中已被证明是一种根除Hp感染的有效方法，但抗生素药物疗法存在诸多弊 端：（1)服用药物剂量较大和治疗周期较长，病人的依从性较差。（2)抗生素药物疗法存在 毒副作用。（3)抗生素药物疗法导致Hp耐药性增强。（4)抗生素药物疗法治疗后难以避免 Hp的重复感染。（5)抗生素药物疗法主要是针对有症状的病人，而无症状的病人仍可能发 展为严重的Hp感染性相关胃病。因此，研制有效的预防性或治疗性Hp疫苗，既可诱发特异 性免疫应答预防或根除Hp感染，毒副作用少，又可避免Hp的重复感染，成为国内外学者竞 相研究的一个热点。
[0003] 幽门螺旋杆菌对胃粘膜屏障的破坏作用主要涉及二种关键因子：（1)黏附因子 (黏附素）：主要指Hp表面的一类蛋白质。Hp可通过黏附因子附着在胃黏膜细胞上，对Hp 的胃部定植起着重要作用。（2)毒力因子：主要指Hp可直接作用于胃黏膜细胞的毒力蛋白， 对胃黏膜细胞起破坏作用。因此，Hp对人类胃部的感染，关键的第一步是通过黏附因子黏 附胃黏膜细胞，而Hp表面的一些关键黏附因子蛋白，主要有Hp尿素酶、黏附素 HpaA、外膜蛋 白Lpp20、CagL等蛋白。幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶（Ure)，约占全菌体蛋白的5%~ 10%，在Hp内部和表面广泛表达，尿素酶由A和B两个亚单位（UreA和UreB)组成。一般细 菌难以在胃部的高酸环境中存活，但Ure能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造 成病理性损伤。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。幽门螺旋杆菌黏附素 HpaA 是Hp鞭毛鞘膜蛋白，几乎存在于所有临床分离的Hp菌株表面，是Hp主要的黏附因子之一， 且氨基酸序列高度保守，动物实验已证明HpaA是定植的必要因子，是Hp疫苗研制的一种理 想的保护性抗原。Lpp20是Hp的另一种外膜蛋白，有研究表明，Lpp20具有良好的免疫原性 和免疫保护性，天然Lpp20蛋白的分离纯化比较困难，给制备Lpp20亚单位疫苗带来了困 难。CagL为幽门螺杆菌外膜伴侣蛋白的一种，由Hp的细胞毒素相关基因毒力岛（cagPAI) 编码并表达于Hp IV型分泌系统（Type IV secretion system，TFSS)菌毛结构的表面蛋白， 桥联TFSS与靶细胞的特异性黏附，不但能激活整合素依赖的细胞信号通路，还具有与纤维 黏连蛋白相似的功能，能直接诱导鼠成纤维细胞形成黏着斑、刺激AGS细胞的扩散。
[0004] 本发明的思路如下：根据机体对Hp的免疫保护性机制，合理预测和筛选Hp尿素酶 A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或表位区 段和分子内黏膜佐剂CTB，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和 多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价黏附因子多表位 疫苗CFAdE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp四价黏附因子多表位疫 苗CFAdE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够激发 BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA、CagL)的T细 胞免疫应答和高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个方面是提供了一种可针对Hp四种关键黏附因子尿素酶、Lpp20、 HpaA和CagL的Hp四价黏附因子多表位疫苗。
[0006] 本发明的第二个方面是提供了 Hp四价黏附因子多表位疫苗的制备方法。
[0007] 本发明的第三个方面是公布了 Hp四价黏附因子多表位疫苗的用途。
[0008] 本发明的第一个方面是提供了一种针对Hp关键黏附因子尿素酶、Lpp20、HpaA和 CagL蛋白的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。该Hp多价表位疫苗主要由黏附因子多表 位肽FAdE和霍乱毒素 B亚基构成，黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列如（序列3)所示， Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的整体氨基酸序列如（序列1)所示。
[0009] 本发明的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE具有以下优点：（I)Hp四价黏附因子 多表位疫苗CFAdE将尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的优势抗 原表位或区段和黏膜免疫佐剂CTB科学合理地整合在一起，可激发针对Hp尿素酶A和B双 亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。（2) Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL蛋白也存在一定的细胞生物学毒性， Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有这4种Hp黏附因子的优势Th和B细胞抗原表位 或区段，避免了其生物学毒性，且能够激发针对这4种Hp黏附因子的高特异性抗体，具有更 高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。（3)以Hp尿素酶A和B双亚基、 外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL等制备Hp四价亚单位基因工程疫苗，存在重组蛋白过大，不 易表达、提取、纯化等问题，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有这4种Hp黏附因子的 优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提取及纯化。（4) Hp黏附因 子抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本发明的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE 采取"偶联分子内免疫佐剂"和"抗原表位多重拷贝"两种设计思路来增强Hp黏附因子抗 原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的 特异性抗体。
[0010] 本发明的第二个方面是提供Hp四价黏附因子多表位疫苗的制备方法，其技术路 线详述如下：
[0011] (I)Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的结构设计
[0012] 根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，通过生物信息学软件合理筛选Hp 尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位及 分子内黏膜免疫佐剂CTB，并对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和 确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。
[0013] (2)重组表达质粒pCznl-CFAdE (含有融合基因 CFAdE)的构建
[0014] 首先构建一个含有霍乱毒素 B亚基（CTB)基因的重组表达载体pCznl-C ;然后通 过基因合成技术合成一个黏附因子多表位肽FAdE (含有Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋 白Lpp20、HpaA和CagL的优势抗原表位或区段）的核苷酸序列，并将其插入重组表达载体 pCznl-C中，构建重组表达载体pCznl-CFAdE。
[0015] (3)重组蛋白CFAdE的原核表达及纯化
[0016] 将重组表达载体pCznl-CFAdE转化进大肠杆菌Arctic Express中，构建重组基因 工程菌株Arctic Express/pCznl-CFAdE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和 层析能够获得高纯度融合蛋白CFAdE，即为Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。
[0017] 本发明的第三个方面是提供了 Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的用途。Hp四 价黏附因子多表位疫苗CFAdE可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。
【附图说明】
[0018] 图I :Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的分子结构设计特点。
[0019] 图2 :重组表达载体pCznl-CFAdE的双酶切鉴定。
[0020] 泳道 M :DNAMarker ;泳道 I :pCznl_CFAdE/Nde I+Hind III ;泳道 2 :酶切前质粒。
[0021] 图3 :重组蛋白CFAdE的原核表达。
[0022] 泳道 M :蛋白质 Marker ;泳道 I :Arctic Express/pCznl-CFAdE 全菌蛋白（未经 IPTG 诱导）；泳道 2:Arctic Express/pCznl-CFAdE全菌蛋白（经 IPTG 诱导 Ih);泳道 3:Arctic Express/pCznl-CFAdE 全菌蛋白（经 IPTG 诱导 2h);泳道 4:Arctic Express/ pCznl-CFAdE 包涵体蛋白（经 IPTG诱导 4h);泳道 5 :Arctic Express/pCznl-CFAdE 可溶性 蛋白（经IPTG诱导4h)。
[0023] 图4 :重组蛋白CFAdE的Ni-NTA亲和层析纯化。
[0024] 泳道M :蛋白质Marker ;泳道I :CFAdE包涵体蛋白（上样蛋白）；泳道2 :杂蛋白； 泳道3 :纯化后的CFAdE蛋白样品。
[0025] 图5 :Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗天然Hp尿素酶（Ure)抗体的检 测。
[0026] Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和天然Hp尿素酶都能诱发较高滴度抗尿素酶 抗体。
[0027] 图6 :Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗UreA抗体的检测。
[0028] Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和Hp尿素酶都能诱发较高滴度的抗UreA抗 体。
[0029] 图7 :Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱