蛋白a免疫吸附柱的灭菌方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物材料及血液净化领域，特别是涉及蛋白A免疫吸附柱的灭菌方法。
【背景技术】
[0002]蛋白A免疫吸附柱主要用于治疗自身免疫性疾病。自身免疫性疾病是指人体的免疫系统发生紊乱，将自身的物质当成外来抗原，产生了一系列免疫反应，导致体内大量自身抗体及免疫复合物的产生，进而破坏人体组织、器官的一大类疾病的总称。包括重症肌无力、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、格林巴利综合症等80余种疾病。由于病因不清，目前对该类疾病仍缺乏有效的药物治疗方法。利用蛋白A免疫吸附柱直接吸附清除病人血液中的自身抗体和免疫复合物，被公认为是目前治疗该类疾病的最有效方法。蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，该蛋白与抗体的Fe段有特异性相互作用，正是利用了蛋白A对抗体的高选择性作用，利用固定化蛋白A合成的亲和吸附柱能够实现对自身免疫性疾病病人血液中大部分免疫复合物和自身抗体的快速清除。在十几年的临床应用中，蛋白A免疫吸附柱在治疗自身免疫性疾病方面已显示出药物治疗无法比拟的独特疗效。
[0003]蛋白A免疫吸附柱属于三类医疗器械，必须保证产品的无菌性。市场上的蛋白A免疫吸附柱主要有Fresenius公司生产的Immunosorb和Prosorb两种，由于蛋白A免疫吸附柱中的吸附剂具有灭菌敏感性，因此一般情况下蛋白A免疫吸附柱并不能进行热压灭菌或者辐照灭菌，其生产过程采用无菌工艺。通过基因改造的方法可以获得特殊氨基酸序列的重组蛋白A，利用该蛋重组白A合成的吸附剂可以耐受蒸汽灭菌(CN 102398717 A)。
[0004]无菌工艺其工艺流程复杂，无菌保证水平较低(无菌工艺的无菌保证水平为千分之一，终端灭菌的无菌保证水平为百万分之一)，一旦染菌也很难挽救损失。而耐受型重组蛋白A的获得需要进行基因工程改造，想要获得理想的目的蛋白工作量较大，目的蛋白的稳定性也需要充分考虑。
[0005]对于灌流器产品，最好的灭菌方法是蒸汽灭菌和辐照灭菌，目前市场上相当多的灌流器产品均采用这两种方法，然而对于蛋白A免疫吸附柱，因这种极端条件的处理会导致吸附柱中活性成分蛋白A的降解变性，从而丧失从血液中清除致病物质的能力。
[0006]因此，为蛋白A免疫吸附柱寻找一种可行的灭菌工艺很有必要。
【发明内容】
[0007]基于此，本发明的目的在于提供一种蛋白A免疫吸附柱的灭菌方法，以实现蛋白A免疫吸附柱的灭菌。
[0008]本发明目的通过以下技术方案实现:
[0009]—种蛋白A免疫吸附柱的灭菌方法，其特征在于，包括以下步骤:将蛋白A免疫吸附剂置于pH为4?7的缓冲液中，装柱后进行蒸汽灭菌。
[0010]在其中一些实施例中，所述方法还包括在所述缓冲液中添加稳定剂，所述稳定剂由以下组分组成:抗氧化剂、多元醇、多糖、螯合剂、增稠剂、多肽或蛋白。
[0011]在其中一些实施例中，所述稳定剂由以下重量份的组分组成:抗坏血酸钠0.2?5份或焦亚硫酸钠0.05?2份、甘油2?40份、甜菊糖I?20份、乙二胺四乙酸0.01?2份、水解明胶0.1?10份、白蛋白0.1?2份；所述稳定剂在缓冲液中的浓度为0.0326?
0.79g/mL0
[0012]在其中一些实施例中，所述稳定剂由以下重量份的组分组成:焦亚硫酸钠0.1?
0.3份、甘油15?25份、甜菊糖13?15份、乙二胺四乙酸0.05?0.2份、水解明胶I?3份、白蛋白0.1?0.3份；所述稳定剂在缓冲液中的浓度为0.2925?0.438g/mL。
[0013]在其中一些实施例中，所述稳定剂由以下重量份的组分组成:焦亚硫酸钠0.2份、甘油20份、甜菊糖15份、水解明胶2份、牛血清白蛋白0.2份、乙二胺四乙酸0.1份；所述稳定剂在缓冲液中的浓度为0.375g/mL。
[0014]在其中一些实施例中，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、酒石酸缓冲液、马来酸缓冲液、硼酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或乙磺酸缓冲液。
[0015]在其中一些实施例中，所述缓冲液的离子浓度为0.1?0.5M。
[0016]在其中一些实施例中，所述缓冲液的pH为5?6。
[0017]本发明中使用的蒸汽灭菌条件为12rC、15min(相当于标准灭菌时间FO =15min)，本发明中使用的降低的蒸汽灭菌条件为115°C、30min(相当于标准灭菌时间FO =8min)和100°C、60min (流通蒸汽灭菌条件，可以作为辅助灭菌手段)。
[0018]本发明中使用的pH值为4?7，优选pH值为5?6。pH对于维持灭菌后吸附剂的活性非常重要、合适的PH范围对蛋白A构象稳定性起到作用。
[0019]本发明中使用的缓冲液的离子浓度为0.02?2.0M,优选0.1?0.5M，该浓度对于维持灭菌后吸附剂的活性是有益的，对于吸附剂的贮存稳定性也是有益的。浓度过低，缓冲能力不足；浓度过高，在贮存过程中可能会出现沉淀，此外，也会给临床使用前的冲洗带来不便。
[0020]本发明中使用的稳定剂有抗氧化剂、多元醇、多糖、螯合剂、白蛋白、增稠剂。抗氧化剂可以防止吸附剂中生物活性成分蛋白A在灭菌条件下被氧化；多元醇和多糖作为稳定剂的机理可以用“优先排阻效应”解释，即多元醇或多糖存在时，其多羟基与溶剂分子形成氢键，使溶剂的表面张力增大，溶液粘度增加，对蛋白质产生排阻效应，蛋白的水化膜减小，结构更加紧凑，从而增加蛋白的稳定性；螯合剂可以络合溶液中某些对蛋白活性有影响的金属离子；白蛋白属于蛋白类保护剂，作为经典、优良的稳定剂应用范围很广；增稠剂可以明显防止白蛋白单独存在时在高温条件下聚集沉淀。
[0021]因此，本发明具有以下有益效果:
[0022]本发明所述灭菌方法，可以防止灭菌过程中蛋白A吸附柱中的活性成分蛋白A的降解变性，维持蛋白A的稳定性，通过这种灭菌工艺，可以使得吸附剂的活性在灭菌后得到保护，从而解决了蛋白A免疫吸附柱不能灭菌的问题，可以实现蛋白A免疫吸附柱产品的最终灭菌。
[0023]本发明所述灭菌工艺获得的蛋白A免疫吸附柱产品，较无菌工艺获得的产品，无菌保证水平更高，且生产成本更低。
【附图说明】
[0024]图1为实施例1的蛋白A吸附剂在不同pH条件下灭菌后的吸附活性图；
[0025]图2为实施例2的蛋白A吸附剂灭菌前后吸附活性图；
[0026]图3为实施例3的蛋白A吸附剂灭菌前后吸附活性图；
[0027]图4为实施例4的蛋白A吸附剂灭菌前后吸附活性图；
[0028]图5为实施例5的蛋白A吸附剂在不同灭菌条件下灭菌前后吸附活性图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0030]实施例1
[0031]本实施例的灭菌方法如下:
[0032]取5g蛋白A吸附剂，加入5ml离子浓度为0.2M，pH3?10的缓冲液(其中pH3?6选择柠檬酸缓冲液，pH7?8选择磷酸缓冲液，pH9?10选择甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，装瓶蒸汽灭菌，灭菌条件为100°C、60min。
[0033]然后按如下方法检测灭菌前后吸附剂的吸附性能:
[0034]