一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明设及一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，属于医学技术领域。
【背景技术】：
[000引随着世界人口的老龄化，阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD)等神经变性疾病 发病率呈明显上升趋势，已成为老年人中最常见的一种痴呆症，是仅次于屯、脑血管、肿瘤之 后又一严重威胁老年人健康的疾病。神经变性疾病的病因和发病机制尚未完全弄清，缺乏 完全模拟AD等神经变性疾病特征的理想动物模型，治疗AD等神经变性疾病缺乏有效药物。 研究AD等神经变性疾病的病因和发病机制，开发治疗AD等神经变性疾病的有效药物，提高 老年人健康质量成为当今生物医学研究领域的重大课题。
[0003] 在真核生物中，自隧是高度保守的过程，它发生在细胞质中，细胞内过多或 异常的细胞器或蛋白质被运输到溶酶体中被降解。在细胞内主要有=种类型的自 隧：巨自隧（macroauto地agy)，微自隧（microauto地ary)和分子伴侣介导的自隧 (chaperonemedi-atedauto地agy，CMA)。运些自隧过程都有一个共同点，即都是在溶酶体中 实现蛋白质的降解。目前，巨自隧在神经退行性病变中的作用尤为受到关注。在自隧的活 性调节中，mTOR是调节自隧信号途径的关键信号分子。mTOR信号途径在控制体内蛋白质平 衡、维持正常神经功能过程中发挥必不可少的作用。mTOR信号途径可W调控许多形式的记 忆和学习功能。在AD动物模型中，mTOR信号途径抑制剂雷帕霉素（"Rapamycin"，一种临 床上的免疫抑制剂，目前临床上也用于治疗神经变性疾病）通过增强自隧来改善认知功能 障碍，其机制与减轻AI3及tau蛋白的病理损伤作用相关。在转基因小鼠模型中，长期使用 雷帕霉素抑制mTOR,可W阻止AD样认知功能障碍，降低AB水平。上述结果表明mTOR抑制 剂可W通过增强自隧，降低AI3、改善认知功能，运为AD模型的改善认知功能障碍的治疗提 供了可行的治疗路径。
[0004] 另外，研究发现TAU蛋白（微管相关蛋白）、BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶 1)、AP蛋白（P-淀粉样蛋白）等分子与阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病等神经变 性疾病有密切关系，运=种蛋白在运类神经变性疾病的病人中的表达量均增高，用于临床 治疗的祀分子药物筛选也主要集中在包括mTOR在内的运四种祀蛋白上。能够有效抑制或 下调mT0R、TAU蛋白、BACE1蛋白、AP蛋白的药物均能够在临床上有效缓解AD、PD和皿等 神经变性疾病。
[0005] 目前临床常用的干预药物主要有雷帕霉素，但运种化合物有极大的毒副作用，不 可能长期服用。所W，筛选有效低毒的抗神经变性疾病的药物或化合物一直是研发临床用 药的难题和重点。
[0006] 同时，大量的研究已证实mTOR与动物的寿命相关，调低mTOR的表达量可延长细胞 和动物体的衰老周期。
【发明内容】
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[0007] 针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种治疗和缓解神经变性疾病的 化合物。
[0008] 本发明的一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，该化合物为青葛素 (Artemisinin)衍生物，所述的青葛素（Artemisinin)衍生物包含葛甲酸（Artemether)、葛 乙酸（Arteether)、青葛班醋（Artesunatum)、双氨青葛素值ihy化oartemisinin)和药学上 可接受的辅料。
[0009] 本发明的有益效果为：它可W治疗早老性痴呆、帕金森氏综合征和亨廷顿病，毒副 作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用，实用性强。
【附图说明】：
[0010] 为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作W详细描述。
[0011] 图1为本发明所述药物组与对照组细胞中祀基因蛋白的凝胶电泳图，
[0012] 图2为本发明所述药物组与对照组各组细胞中祀基因蛋白表达情况。
【具体实施方式】：
[0013] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中示出的具体 实施例来描述本发明。但是应该理解，运些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范 围。此外，在W下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，W避免不必要地混淆本发明的 概念。
[0014] 如图1所示，本【具体实施方式】采用W下技术方案：该化合物为青葛素 (Artemisinin)衍生物，所述的青葛素（Artemisinin)衍生物包含葛甲酸（Artemether)、葛 乙酸（Arteether)、青葛班醋（Artesunatum)、双氨青葛素值ihy化oartemisinin)和药学上 可接受的辅料。
[0015] 进一步的，药学上可接受的辅料包含异丙醇、乙醇、苯甲醇、肉豆寇酸异丙醋、正丙 醇、丙S醇、二甘醇、S乙酸甘油醋、二甲基甲酯胺、二甲基亚讽值MS0)、S甘醇、油酸乙醋 等。
[0016] 进一步的，该化合物还包含其临床制剂。
[0017] 本【具体实施方式】通过细胞试验显示：青葛素衍生物可作用于引起早老性痴呆和 帕金森氏综合征的相关祀蛋白，同时也作用于与衰老相关的祀蛋白。明显下调了引起上述 疾病的祀分子浓度和与衰老相关的祀分子浓度。青葛素衍生物在小鼠口服的半数致死量 (LD50)为895~977mg/kg，大鼠肌内注射油剂的LD50为597mg/kg，并已被用于临床治疗追 疾和肿瘤，是一类安全有效的药物分子。动物脑胶质瘤原位抑制实验和恶性追引起的脑型 追临床用药显示青葛素及其衍生物可透过血脑屏障进入大脑。
[0018]青葛素（Artemisinin)衍生物包括葛甲酸（Artemether)、葛乙酸（Arteether)、青 葛班醋（Artesunatum)和双氨青葛素值ihy化oartemisinin)等药物已在临床上用于治疗 追疾，更为重要的是利用该药或化合物具有透过血脑屏障的特性，用于治疗脑型追疾并具 有显著疗效。近年的研究发现，青葛素及其衍生物如葛甲酸在体内外有明显的抗肿瘤和抑 制肿瘤细胞生长的作用，且不产生赖药性及不良反应。本研究发现青葛素及其衍生物具有 下调和降低TAU蛋白（微管相关蛋白）、BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶1)、AP蛋白 (e-淀粉样蛋白）和mTOR蛋白表达浓度的活性，其主要的作用机制如下所述：
[0019] 1、下调神经元外的P-淀粉样蛋白（P-amyloidp;rotein，AP)的浓度：在细胞水 平上青葛素及其衍生物能够明显下调神经元外的P-淀粉样蛋白（P-amyloidprotein， A0)的浓度和表达量，且具剂量依赖性。
[0020] 2、下调TAU蛋白（微管相关蛋白）的浓度：在细胞水平上青葛素及其衍生物能够 明显下调TAU蛋白（微管相关蛋白）的浓度和表达量，且具剂量依赖性。
[0021] 3、下调BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶1)的浓度：在细胞水平上青葛素及 其衍生物能够明显下调BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶1)的浓度和表达量，且具剂 量依赖性。
[002引 4、下调mTOR蛋白的浓度：在细胞水平上青葛素及其衍生物能够明显下调mTOR的 浓度和表达量，且具剂量依赖性。
[0023] 青葛素及其衍生物用于治疗脑型追和脑胶质瘤的优势在于该药能够透过血脑屏 障，杀死追原虫和诱导脑胶质瘤细胞调亡。神经变性疾病的病灶也主要集中于大脑，青葛素 及其衍生能够透过血脑屏障进入大脑为该类药物或化合物发挥作用提供了前提条件，加之 体外研究的结果已证实青葛素及其衍生能够显著下调和降低与阿尔茨海默病、帕金森氏病 和亨廷顿病等神经变性疾病有密切相关的TAU蛋白、BACE1蛋白、AP蛋白和mTOR等分子表 达量和浓度。该类药物或化合物具有毒副作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用等 优点。
[0024] 通过对IC50 (半数抑制率）的研究，其用量可为10-150mg/kg/。
[00巧]试验研究结果显示：青葛素及其衍生物对体外培养的N2a细胞株中的mT0R、TAU蛋 白、BACE1蛋白、AP蛋白度eta)表达浓度均能够有效抑制或明显下调，且具剂量依赖性。
[0026] 测定葛甲酸对N2a小鼠神经母细胞瘤的抑制作用。
[0027] 实验试剂：DMEMF12培养基购自美国GIBC0公司；胎牛血清购自美国GIBC0公司， 嚷挫蓝（MTT)购自美国SIGMA公司，DMS0购自美国SIGMA公司。
[0028] 主要仪器：二氧化碳培养箱（美国化rma公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）； 无菌操作台（美国Forma公司）。
[0029] 细胞株及细胞培养：小鼠神经母细胞瘤细胞株N2a用含10%胎牛血清的DMEMF12 细胞培养基于37°C，5%C02恒溫培养箱中常规培养。
[0030] 药物：葛甲酸（昆明制药集团股份有限公司，50mg)。
[0031] 试验方法：
[00础 1.四甲基偶氮挫盐法（MTT法）：
[0033]取对数生长期N2a细胞，调整细胞悬液为1X105个/mL。取=个96孔板，在细 胞y板的外周各孔均加入200iiL的新鲜培养基，其它各孔每孔用移液器加入细胞浓度为 1X105个/mL的细胞悬液200y以使每孔细胞数2. 0X104个，其中设置空白对照组1个包 括6个复孔、实验组9个在此后的实验中依次用于加入不同浓度的药液（800、400、200、100、 50、25、12. 5yg/mL)，每个浓度的药物组均设6个复孔，置37°C、5%C02培养箱中培养24h; 取出96孔板，用移液器小屯、吸去上清液，实验组每孔分别加入用完全培养液配制的相应浓 度的药物溶液200y以每个浓度6个复孔。空白对照组加200yL的完全培养液，置37°C， 5%C02培养箱中分别培养24h、48h、72h;称取50mgMlT溶于5血PBS中，过滤，避光保存； 取出已培养到相应时间的培养板，用5mL注射器吸干孔内的液体，每孔加入20yLMIT溶 液，放入培养箱内继续解育也去除MTT，每孔加入150yLDMSO,暗处振荡15min，450型 ELISA-Reader酶标仪度io-Rad公司）490皿主波长，630皿副波长检测吸光度。W对照组细 胞活力为100%，按公式计算不同浓度葛甲酸对N2a细胞增殖的抑制率：细胞抑制率（％ ) =(1 -药物组吸光度/对照组吸光度）X100%。借助SPSS17. 0软件求的IC50值。
[0034] 2.蛋白印迹法（Westernblot)检测祀基因蛋白量
[0035] 2. 1单层贴壁细胞总蛋白提取
[0036] 取出已加药处理48h的小鼠神经母瘤细胞，去除培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上 使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立