RAMPSe。。对照组（P<〇. 05)，表明 YPF-PStp可W提高CD4 +淋己细胞百分率（表6和图4)。
[0059] 表6在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD4+的影响（n= 4)
[0060]
阳06U (5)CD8叮淋己细胞亚群的变化
[0062] 在所有时间点，试验组的CD8+淋己细胞百分率均显著高于空白对照组（P<0. 05)， 多糖处理细胞48h、7化后，CD8+淋己细胞百分率显著高于PHA对照组（P<0. 05)，RAMPStp处 理细胞4化后，CD8+淋己细胞百分率显著高于RAMPSe。。对照组（P<〇. 05)，表明YPF-PStp可 W提高CD8+淋己细胞百分率（表7和图5)。
[0063] 表7在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD8+的影响（n= 4)
[0064]
[0066] 实施例4、体内对维鸡新城疫疫苗免疫应答的比较
[0067] 方法：W玉屏风多糖为试验材料，另制备对照方1 (RAMPSe。。）和对照方2 (RAMPStp)。 将健康1日龄海兰褐维公鸡210只，随机分为6组，除空白对照组度C组）外均用新城疫 IV系苗免疫，28日龄二免。在首次免疫的同时，1-3组分别肌肉注射6mg.mL1的YPF-PStp、 RAMPStp和RAMPSeoc0.5血，4组化ev组）口服盐酸左旋咪挫0.5血（lOmg.kg1)，无佐剂对照 组（NA组）注射等量生理盐水。分别于首次免疫后第7、14、21、28d翼静脉采血检测血清HI 抗体效价，屯、脏采血测定外周血T淋己细胞增殖、细胞周期、CD4\CD8叮淋己细胞亚群的变 化，处死维鸡后称取胸腺、脾脏和法氏囊的重量，计算免疫器官指数。
[0068]结果：
[0069] (1)血清ND-HI抗体效价变化 阳070]血清ND-HI抗体效价变化见于表8和图6。免疫后第7、14山YPF-PStp、RAMPStp和RAMPSe。。组的抗体效价显著高于无佐剂组（P<0. ;YPF-PStp和RAMPStp组的抗体效价显著 高Lev对照组；YPF-PStp组的抗体效价最高，其次为RAMPStp组。 阳0川免疫后第21、28山YPF-PStp、RAMPStp、RAMPSe。。和Lev组的抗体效价显著高于无佐 剂组（P<0. ;YPF-PStp、RAMPStp和RAMPSe。。组的抗体效价显著高Lev对照组（P<0. ; YPF-PStp和RAMPStp组的抗体效价显著高RAMPSe。。组；YPF-PStp组的抗体效价最高。 阳0巧表8血清ND-HI抗体效价的变化化0拓，n= 6)
[0073]
[0074] 似外周血T淋己细胞增殖的变化 阳07引免疫后第7、14d，YPF-PStp和RAMPStp组的A57。值均显著高于Lev对照组（P<0.0リ。 而RAMPSe。。组的A日7。值与Lev对照组的差异不显著（P〉0. 05)。在14山YPF-PStp组的A57。 值均显著高于RAMPSe。。组（P<0. 05)。免疫后第 21、28d，YPF-PStp、RAMPStp和RAMPS日。。组的 As7。值均显著高于Lev对照组（P<0. 05)。在21d，YPF斗SW和RAMIESW组的A57。值均显著高 于RAMPSeoc组；在28山YPF-PStp组的A的。值均显著高于RAMPS6化组（表9)。
[0076]表9外周血T淋己细胞增殖的变化（A日wvalue，n= 4)
[0077]
[007引 （3)免疫器官指数的变化
[0079] ①胸腺指数的变化
[0080] 胸腺指数的动态变化见表10和图7。免疫后第7山YPF-PStp和RAMPStp组的胸腺 指数显著高于Lev对照组（P<0. 05)。而RAMPSe。。组的胸腺指数与Lev对照组的差异不显著 (P〉0. 05)。在首免后第14山只有YPF-PStp组的胸腺指数显著高于Lev对照组（P<0. 05)。 在28山YPF-PStp和RAMPStp组的胸腺指数显著高于RAMPSe。。组。 W81] 表10各组胸腺指数的动态变化（g.kg1，n= 4)
[0082]
[008引②脾脏指数的变化
[0084] 脾脏指数的动态变化见表11和图8。免疫后第7山YPF-PStp和RAMPS tp组的脾 脏指数显著高于Lev对照组（P<0. 05)，RAMPSe。。组的胸腺指数与Lev对照组的差异不显著 (P〉0. ，YPF-PStp组的脾脏指数显著高于RAMPSe。。组（P<〇. 。免疫后第14、21、28山 YPF-PStp、RAMPStp和RAMPSe。。组的脾脏指数显著高于Lev对照组（P<0. 05)。在14、28山YPF-PStp和RAMPStp组的脾脏指数显著高于RAMPS日化组。 W85] 表11各组脾脏指数的动态变化（g.kg1，n= 4)
[0086]
[0087]③法氏囊指数的变化 阳0蝴法氏囊指数的动态变化见表12和图9。免疫后第7、14山YPF-PStp和RAMPStp组 的法氏囊指数显著高于Lev对照组和RAMPSe。。组（P<0. 05)。而RAMPSe。。组的法氏囊指数与 Lev对照组的差异不显著（P〉0. 05)。
[0089] 免疫后第21、28山YPF-PStp、RAMPStp和RAMPS 6。。组的法氏囊指数显著高于Lev对 照组（P<0.。在21山YPF-PStp和RAMPS tp组的法氏囊指数显著高于RAMPS e。。组；在28山YPF-PStp组的法氏囊指数显著高于RAMPS e。。组。 W90] 表12各组法氏囊指数的动态变化（g.kg1，n= 4)
[0091]
[0092] (4)淋己细胞周期的变化 阳09引免疫后维鸡淋己细胞周期的分布见于表13和图10。免疫后第7、14d，YPF-PStp、RAMPStp和RAMPS e。。组的各周期分布显著不同于Lev和无佐剂对照组（P<0. 05);与Lev对 照组相比较，YPF-PStp和RAMPS tp组G0/G1期细胞的百分比明显降低（P<0. 05)，处于S期和 G2/M期的细胞百分比明显增多任<0.05)。YPF-PStp和RAMPStp组的各周期分布也显著不同 于RAMPSe。。组。免疫后21、28山YPF-PS tp、RAMPStp和RAMPS 6。。组都可W显著降低G0/G1期细 胞的百分比（P<〇. 05)，S期和G2/M期的细胞百分比明显增多（P<0. 05)。与AMPSe。。相比较， YPF-PStp和RAMPS W组免疫21d后，YPF-PStp组免疫28d后，G0/G1期细胞的百分比明显降 低，S期细胞百分比明显增多（P<0. 05)。
[0094] 免疫后所有时间点，与Lev组相比，YPF-PStp和RAMPStp组对淋己细胞周期的SPF 值、PI值的影响均显著（P<〇.05)。YPF-PStp和RAMPStp组免疫21d后，与RAMPS6。。组相比较，SPF值和PI值明显升高（P<0.05)(表14和15)。 阳0巧]YPF-PStp组免疫21d后，S期细胞的百分比的升高效果最显著，其SPF值、PI值也 均最大，效果最明显。
[0096] 表13在不同时间点对鸡淋己细胞周期分布的影响（n=4)
[0097]
[0098]
阳10引 妨外周血CD4\CD8+T淋己细胞亚群的变化
[0104] 免疫后所有时间点，试验组的CD4+淋己细胞百分率均显著高于无佐剂对照组 (P<0. 05)，YPF-PStp和RAMPStp的CD4 +淋己细胞百分率显著高于Lev对照组（P<0. 05);YPF-PStp组免疫后7、14d，YPF-PStp和RAMPStp组免疫后21、28d，CD4 +淋己细胞百分率显著 高于RAMPSe。。对照组（P<0. 05)，表明YPF-PStp可W提高CD4 +淋己细胞百分率（表16和图 11)。
[01化]免疫后所有时间点，试验组的CD8+淋己细胞百分率均显著高于无佐剂对照组 (P<0. 05)，YPF-PStp和RAMPStp的CD8 +淋己细胞百分率显著高于Lev对照组（P<0. 05); YPF-PStp组免疫后7、14、28d，YPF-PStp和RAMPStp组免疫后21d，CD8 +淋己细胞百分率显著 高于RAMPSe。。对照组（P<0. 05)，表明YPF-PStp可W提高CD8 +淋己细胞百分率（表16和图 11)。 阳106]表16在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD4\CD8+的影响（n= 4) 阳107]
[0108] W上结果表明，玉屏风多糖免疫增强剂能显著增强新城疫疫苗免疫维鸡的血清抗 体效价，促进外周淋己细胞增殖，促进淋己细胞进入S期和G2/M期，提高CD4\CD8+T淋己细 胞亚群的百分率，提高维鸡免疫器官指数，通过运些指标的检测，我们可W看出玉屏风多糖 能显著提高新城疫疫苗的免疫效果。
[0109] 发明人进一步确定玉屏风免疫增强剂的剂量为6mg血1X0. 5血X3天；由此确定 了玉屏风多糖作为新城疫疫苗免疫增强剂时的具体用量为：每单位剂量疫苗配合9mg中药 免疫增强剂使用。
【主权项】
1. 一种新城疫疫苗玉屏风多糖免疫增强剂，其特征在于：成分为玉屏风多糖，所述的 玉屏风多糖采用黄芪、白术、防风按质量比3:1: 1，通过水煎-醇沉法制备而得； 其中所述玉屏风多糖是按如下方法提取的： 以玉屏风散1000 g计，将黄芪、白术、防风按质量比3:1:1配置成1000 g玉屏风散，加 入8倍质量的水浸泡30min ;之后煮沸lh，过滤后药渣加入6倍质量的水煮沸lh，过滤后滤 渣再次加入6倍质量的水煮沸Ih过滤，合并三次滤液，将滤液加热浓缩至lOOOmL，冷却后 3000rpm离心10min，除去杂质，蒸馏水定容制成1000 mL ;用一步醇沉法提取，向上述浓缩液 中缓慢加入95wt %乙醇使混合液中乙醇的终浓度达80wt %，边加边搅拌，添加完成后静置 24h，离心，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即得玉屏风总多糖一YPF-PSte; 对上述获得的玉屏风总多糖行纯化，具体步骤如下： 分别取YPF-PSte500mg溶解于IOmL蒸馏水中，得到50mg. mL 1样品，之后层析柱 (I. 6cmX90cm)，介质为Sephadex A-25,流速0. 42mL ? min 1上样，之后米用分部收集，用 0? 05mol ? L 1NaCl和Imol ? L 1NaCl各400mL梯度洗脱，洗脱液经透析袋透析去除氯化钠和 杂质即得纯化多糖。2. 如权利要求1所述的新城疫疫苗玉屏风多糖免疫增强剂，其特征在于：所述的玉屏 风总多糖作为免疫增强剂时的具体用量为：每单位剂量疫苗配合9mg中药免疫增强剂使 用。
【专利摘要】本发明属于畜禽免疫领域，提供了一种畜禽免疫佐剂，具体公开了一种新城疫疫苗玉屏风多糖免疫增强剂，主要采用黄芪、白术、防风按质量比3:1:1，通过水煎-醇沉法制备而得，其重要成分为玉屏风多糖；采用这种免疫增强剂，与疫苗配合使用，能增强动物免疫功能，提高动物的抗病力和疫苗的保护率，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价值。
【IPC分类】A61K36/481, A61P37/04, A61K39/39, A61P31/14, A61K31/715
【公开号】CN105147716
【申请号】CN201510385579
【发明人】赵晓娜, 孙文静, 刘建柱, 马藤菲, 郝盼, 王胜华
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年6月30日