离子配位沉淀法纯化苹果多酚的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种Mn+离子配位沉淀法纯化苹果多酚的方法。
【背景技术】
[0002] 苹果多酸（Apple Polyphenols，AP)是一种天然活性多酸，也是一种天然抗氧化 剂，属于植物多酚的一种，AP存在于苹果的各个部位中，它不是一种单一的物质，而是苹果 内所含有的所有酚类物质的总称。天然活性多酚的纯化方法主要有：溶剂萃取法、树脂吸 附法、柱层析法、膜分离技术、高速逆流色谱法等。苹果多酚作为一种天然活性多酚，它的纯 化方法也离不开上述几种。研究表明实验室针对于苹果多酚的纯化，大多都先采用不同的 方法进行初步提取，然后在得到的苹果多酚粗提液的基础上进行进一步纯化，例如首先通 过超声波提取法初步提取国光苹果中的苹果多酚，然后通过研究AB-8大孔树脂对苹果多 酚的吸附特性，找出适合于苹果多酚分离纯化的条件（金莹，2006)。通过四元二次通用旋 转设计辅助微波法确定了苹果渣中多酚的最佳提取工艺；针对苹果多酚粗提物，利用大孔 吸附树脂S印hadex LH-20脂对苹果多酚进行纯化（郭娟，2006)。应用超声波辅助乙醇初 提苹果皮渣多酚然后通过选取NKA-9大孔树脂法继续纯化得到纯度为72%苹果皮渣多酚 粉末（李珍，2014)。同样通过对大孔树脂静态吸附和解析综合研究，在16种树脂中选择 NKA-9大孔树脂来纯化苹果多酚粗提液，近年来脂吸附纯化法慢慢开始走出实验室朝着工 业化进行发展（王育红，2007)。此外在其他技术的应用上，利用膜分离技术研究了烟台红 富士苹果多酚氧化酶的分离纯化条件（刘芳，2015)。研究了固相萃取法，从四种固相萃取 小柱中筛选出分离效果较好的Waters Oasis HLB固相萃取小柱对苹果多酚进行纯化（贺 金娜，2014)。树脂吸附法及柱层析吸附分离法因材料价格高，材料再生存在一定问题，因此 鲜少应用于工业化生产；膜分离技术和高速逆流色谱法等新方法近年仍处于实验室研究阶 段，实现工业化尚有一定困难。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决现有纯化苹果多酚的方法存在成本高、苹果多酚提取率低的问题， 而提供了一种M n+离子配位沉淀法纯化苹果多酚的方法。
[0004] 本发明一种Mn+离子配位沉淀法纯化苹果多酚的方法是通过以下步骤进行的：
[0005] -、原料预处理：将新鲜的苹果切成Im3~3m3的小块，在温度为70°C~80°C的水 中漂烫8s~IOs后破碎得到匀浆；
[0006] 二、微波辅助粗提取：将步骤一得到的匀浆加入到质量浓度为50%的乙醇中，然 后在微波功率为640W的条件下进行粗提取，粗提取的时间为70s，得到苹果多酚粗提取液； 所述步骤一得到的勾衆的质量与质量浓度为50%的乙醇的体积比为lg: 14mL ;所述苹果多 酚粗提取液中苹果多酚的含量为8. 93mg/g~9. 92mg/g ;
[0007] 三、将步骤二得到的苹果多酚粗提取液采用质量浓度为1%~5%的氨水将pH值 从3. 8~4. 5调整至5~9,得到调节后的苹果多酚粗提取液；向调节后的苹果多酚粗提取 液中投加Mn+离子，然后在离心转速为500rpm~4000rpm、离心时间为IOmin~70min和pH 值为5~9的条件下进行离心，静置lOmin，得到纯化后的苹果多酚沉淀物；所述Mn+离子 由Mn+金属盐提供的；所述M n+金属盐的质量与步骤二得到的苹果多酚粗提取液的体积比为 Ig:(35 ~500)mL ;
[0008] 四、沉淀物转溶提取：将步骤三得到的纯化后的苹果多酚沉淀物加入到浓度为 lmol/L的盐酸中至沉淀物完全溶解，得到转溶后的苹果多酚样液，然后再向转溶后的苹果 多酚样液中加入乙酸乙酯萃取，冷冻干燥得到棕红色粉末状苹果多酚；所述转溶后的苹果 多酚样液与乙酸乙酯的体积比为1:1。
[0009] 本发明的有益效果在于：
[0010] 本发明采用金属离子纯化粗提液中的苹果多酚，首先环保节能，降低成本；其次， 方法安全快捷可操控；更重要的是，该方法得到的苹果多酚沉淀率高，纯化后所得到的苹果 多酚色泽棕红，略带果香。苹果多酚沉淀率可达93. 98%。
【附图说明】
[0011] 图1为不同ZnCl3添加量与苹果多酚沉淀率的关系曲线；
[0012] 图2为不同pH值与苹果多酚沉淀率的关系曲线；
[0013] 图3为不同离心转速与苹果多酚沉淀率的关系曲线；
[0014] 图4不同离心时间与苹果多酚沉淀率的关系曲线。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0015] 一：本实施方式一种Mn+离子配位沉淀法纯化苹果多酚的方法是通 过以下步骤进行的：
[0016] -、原料预处理：将新鲜的苹果切成Im3~3m3的小块，在温度为70°C~80°C的水 中漂烫8s~IOs后破碎得到匀浆；
[0017] 二、微波辅助粗提取：将步骤一得到的匀浆加入到质量浓度为50%的乙醇中，然 后在微波功率为640W的条件下进行粗提取，粗提取的时间为70s，得到苹果多酚粗提取液； 所述步骤一得到的勾衆的质量与质量浓度为50%的乙醇的体积比为lg: 14mL ;所述苹果多 酚粗提取液中苹果多酚的含量为8. 93mg/g~9. 92mg/g ;
[0018] 三、将步骤二得到的苹果多酚粗提取液采用质量浓度为1%~5%的氨水将pH值 从3. 8~4. 5调整至5~9,得到调节后的苹果多酚粗提取液；向调节后的苹果多酚粗提取 液中投加Mn+离子，然后在离心转速为500rpm~4000rpm、离心时间为IOmin~70min和pH 值为5~9的条件下进行离心，静置lOmin，得到纯化后的苹果多酚沉淀物；所述M n+离子 由Mn+金属盐提供的；所述Mn+金属盐的质量与步骤二得到的苹果多酚粗提取液的体积比为 Ig:(35 ~500)mL ;
[0019] 四、沉淀物转溶提取：将步骤三得到的纯化后的苹果多酚沉淀物加入到浓度为 lmol/L的盐酸中至沉淀物完全溶解，得到转溶后的苹果多酚样液，然后再向转溶后的苹果 多酚样液中加入乙酸乙酯萃取，冷冻干燥得到棕红色粉末状苹果多酚；所述转溶后的苹果 多酚样液与乙酸乙酯的体积比为1:1。
[0020] 本实施方式步骤一中所述新鲜的苹果为市售的红富士，因为苹果多酚存在于苹果 中的各个部位，红富士苹果体积大，果肉多，果皮厚，其苹果多酚含量高于其他常见苹果种 类。
[0021] 本实施方式步骤二中所述苹果多酚粗提取液中苹果多酚的含量是通过福林酚 法进行测量的；其方法如下：首先以没食子酸（C 7H6O5)标准品为对照品，称取IOmg C7H6O5 用蒸馏水定容至IOmL容量瓶；其次分别吸取0mL、0. lmL、0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL和 0. 6mLC7H605溶液定容到IOmL容量瓶，所得溶液的质量浓度分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、 40mg/L、50mg/L和60mg/L ;然后取37. 5g无水Na2CO3用250mL温蒸馏水溶解于500mL烧杯 中，用玻璃棒不停搅拌，冷却后定容至500mL容量瓶；
[0022] 线性回归方程：再次分别吸取ImL不同质量浓度的(：71160 5溶液至IOmL容量瓶内， 依次加入5mL蒸馏水和ImL福林-式剂，4min后加入3mL 150g/L的Na2CO3溶液，显色2h， 并用紫外分光光度计测定A765nni的值。最后进行3组平行试验。以没食子酸含量为横坐标， 吸光度为纵坐标，得回归方程为Y = 0. 0126X-0. 0236, r2= 0. 9952,由此可知横纵坐标在一 定范围内线性相关且相关性显著。所述苹果多酚粗提取液中苹果多酚的含量为T，其计算公
式中：C为没食子酸的含量，单位为y g/mL ;V为浓度为50%的 乙醇，单位为mL ;M为步骤一得到的匀浆质量，单位为g ;N为稀释倍数，是稀释前溶液浓度， 除以稀释后的溶液浓度所得的商。
[0023] 本实施方式步骤四中所述棕红色粉末状苹果多酚的沉淀率的计算公式为：
;式中
1为沉淀前AP浸提液体积（mL)，V 2为调PH之后，沉淀浸提 液的体积（mL) ;A#沉淀前AP浸提液测得的吸光度；A AAP沉淀后上清液测得的吸光度。
[0024] 本实施方式步骤三中调节pH时所用的试剂是氨水，氨水浓度不可太高，因为步骤 二得到的苹果多酚粗提取液本身PH值3. 8~4. 5,过高浓度氨水不易调节步骤二得到的苹 果多酚粗提取液PH值，所以氨水浓度控制在1 %~5%之间便于调节步骤二得到的苹果多 酚粗提取液PH值。
【具体实施方式】 [0025] 二：本实施方式与一不同的是：步骤三中所述Mn+离子 为Ca 2+离子、Mg 2+离子、Ba 2+离子、Zn 3+离子或Fe 3+离子。