一种基于ppv病毒样颗粒的纳米递药系统及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，具体涉及靶向多肽（TK肽） 修饰的PPV衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒所构成的主动靶向纳米递药系统及其制备方 法，该主动靶向纳米递药系统包载小分子抗肿瘤药物后，可用于靶向治疗结肠癌。本发明属 于多肽、生物技术和药剂学领域。
【背景技术】
[0002] 中国肿瘤生物治疗协会2013肿瘤发展报告统计数据表明，恶性肿瘤占所有死亡 人数的20%左右；每年肿瘤疾病的发病率和死亡率都在急剧增加着，《2012中国肿瘤登记 年报》发布的最新统计数据表明，中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万， 全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，恶性肿瘤已经成为危害人类生命和健康的头号杀手。 结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在男性和女性恶性肿瘤中分别居第三位和第二 位，2008年新发癌症患者超过120万，有60. 87万癌症患者死于结直肠癌。在我国，结直肠 癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位，严重危害人类健康。因此，如何有效治疗结直肠 癌已成为全球健康领域亟待解决的难题。相关研究表明，靶向性给药可以增强药物在靶部 位的活性并减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数，给药系统是靶向治疗的 关键。近年来本领域的研究重点之一是寻找与可特异性与肿瘤细胞或肿瘤新生血管结合的 物质，以及将药物递送到肿瘤的新型递药系统。
[0003] 病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白 的空心颗粒，因为VLPs不含有病毒核酸物质，不能自主复制，因此也不具有感染性。猪细小 病毒（Porcineparvovirus，PPV)是细小病毒科细小病毒属成员，PPV基因组编码两条结构 多肽VPl和VP2,三条非结构多肽NS1、NS2和NS3。VP2分子质量为64ku，约占病毒衣壳蛋 白总量的80 %，在一定的环境下，VP2能自组装成VLPs，其形态与PPV相似。病毒样颗粒虽 然是安全、有效的纳米载体，但是VLPs选择性相对较差，缺乏对肿瘤细胞的特异性。因此， 通过靶向分子介导VLPs对肿瘤细胞的选择性，是一种有效的主动靶向方式。目前尚无靶向 分子修饰的PPV-VLPs的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有抗癌化学药物的毒性及非特异性问题，提供一种新型的 主动靶向纳米递药系统。
[0005] 为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：
[0006] -种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，其特征在于，是由纳米载体材料和药 物组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统 制备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳 米载体材料内。
[0007] 在本发明中，优选的，所述的TK肽为靶向多肽，其氨基酸序列为：TWYKIAFQRNRK; 所述的PPV病毒样颗粒为PPV的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒；TK肽与PPV病毒样颗粒 的摩尔比为1:1~20:1。
[0008] 在本发明中通过控制AVP2基因中TK肽的基因与VP2基因的拷贝数来调节TK肽 与PPV病毒样颗粒的摩尔比。
[0009] 在本发明中，优选的，所述的TK肽修饰的PPV病毒样颗粒通过以下方法制备得到： 将TK肽的基因插入PPV的VP2基因中，得到AVP2基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HA中，所得的重组杆状病毒转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，得到重组杆粒，重 组杆粒转染Sf9昆虫细胞，使其表达AVP2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的方法包括以下步骤：
[0011] ⑴以提取的PPVDNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2基因，将VP2 基因插入PMD18-T载体中，得到重组载体pMD18-T-vp2 ;
[0012] (2)以重组载体pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增获得AVP2基因，将AVP2 基因插入杆状病毒转移载体pFastBacHA中，得到pFD-AVP2供体质粒；
[0013] (3)将pFD-Avp2供体质粒转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，与Bacmid进行重 组，得到重组杆粒Bacmid-Avp2 ;
[0014] (4)将重组杆粒Bacmid-AVP2转染Sf9细胞，待细胞病变达到70%以上收集上清 培养液，即第一代重组杆状病毒，连续传代后，以第三代重组杆状病毒作为种毒；
[0015] (5)将得到的第三代重组杆状病毒接种Sf9细胞，使其表达AVP2蛋白并组装成 TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。
[0016] 在本发明中，优选的，步骤（1)中所述的引物的核苷酸序列为SEQIDNO: 1和SEQ IDNO: 2所示；步骤（2)中SOE-PCR扩增AVP2基因的具体步骤为：第一轮扩增使用引物 P1/P2,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片段命名P1-P2 ;引物P3/P4,模板为pMD18-T-vp2， 获得的目的片段命名P3-P4 ;引物P5/P6,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片段命名P5-P6 ; 第二轮扩增使用引物P1/P4,模板为P1-P2和P3-P4,获得目的基因片段P1-P4 ;使用引物 P3/P6,模板为P3-P4和P5-P6,获得目的基因片段P3-P6 ;第三轮扩增使用引物P1/P6,模板 为P1-P4和P3-P6,获得目的基因片段P1-P6,即AVP2基因；引物P1-P6的核苷酸序列为 SEQIDNO:3-SEQIDNO:8 所示。
[0017] 在本发明中，优选的，所述的纳米递药系统的平均粒径为10-100nm。
[0018] 在本发明中，优选的，所述的小分子抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、喜树碱、羟 基喜树碱、紫杉醇或多系紫杉醇中的一种。
[0019] 进一步的，本发明提供了一种制备所述的纳米递药系统的方法，采用昆虫杆状病 毒表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，将小分子抗肿瘤药物通过包裹或共价连接的 方式包载在TK肽修饰的PPV病毒样颗粒内。
[0020] 在本发明中，优选的，采用昆虫杆状病毒表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗 粒，将TK肽修饰的PPV病毒样颗粒、N-羟基丁二酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亚胺和小分子抗肿瘤药物按照质量比1:5:2:10~1:5:2:40的比例放入离心管中，4°C反 应48h，反应后的样品装入透析膜中进行透析，透析液为pH7. 4的磷酸盐缓冲液，4°C透析 48h，期间每隔12h换液一次，即得。
[0021] 更进一步的，本发明提供了所述的纳米递药系统在制备靶向治疗结肠癌细胞药物 中的用途。
[0022] 在本发明中，优选的，所述的结肠癌细胞为人结直肠腺癌HRT-18细胞或人结肠癌 Cao-2细胞。
[0023] 本发明同时还提供了所述TK肽的合成方法与亲和性评价，及其修饰的纳米递药 系统的制备方法、靶向性评价及抑瘤效果等，其包括：
[0024] (1)合成TK肽
[0025] 采用固相合成的方法合成TK肽（TWYKIAFQRNRK)，并进一步通过化学合成的方法 获得荧光素标记的TK肽（FITC-TK)，HPLC及MS表征其结构。
[0026] (2)TK肽的亲和性评价
[0027] 通过与受体蛋白结合能力及结肠癌肿瘤的结合能力两方面进行TK肽性质考察， 采用表面等离子共振方法（SPR)测定TK肽与受体蛋白的结合常数Kd值。比较FITC与 FITC-TK对结肠癌细胞的靶向性。
[0028] (3)TK-VLPs纳米载体的制备
[0029] 通过提取PPV病毒基因组，进一步通过SOE-PCR扩增获得AVP2基因，从而获得 pFD-Avp2供体质粒，进而构建重组杆状病毒Bacmid质粒，重组杆状病毒Bacmid质粒转染 Sf9细胞，得到重组杆状病毒，重组杆状病毒接种Sf9细胞，制备TK肽修饰的PPV病毒样颗 粒，用于TK-VLPs纳米载体的制备。
[0030] (4)载药TK-VLPs纳米递药系统的制备与表征
[0031] 以阿霉素为模型药物，与一定比例的VLPs或TK-VLPs纳米载体通过化学反应，形 成载药的TK-VLPs-DOX纳米递药系统。激光散射法测定粒径及粒径分布；负染色电镜法观 察TK-VLPs-DOX的形态。
[0032] (4)载药TK-VLPs纳米递药系统的肿瘤靶向性评价
[0033] 考察Cao-2及HRT-18细胞对VLPs-DOX和TK-VLPs-DOX纳米递药系统摄取情况， 比较上述两种递药系统对肿瘤细胞的亲和能力。
[0034] (5)载药TK-VLPs纳米递药系统的抗肿瘤效果评价
[0035] 以MTT法研究VLPs-DOX和TK-VLPs-DOX纳米递药系统对Cao-2及HRT-18细胞体 外生长抑制效果。
[0036] 实验结果表明，所述的TK肽与受体蛋白和肿瘤新生血管及结肠癌肿瘤均具有较 高的亲和活性；