针对典型性猪瘟病毒的嵌合疫苗抗原的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200780014628. 5的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及动物健康领域，特别地涉及在猪中形成针对此类病毒的早期且强有力 的免疫应答的新型嵌合抗原，其包含与刺激细胞和体液免疫系统的蛋白质分子相偶联的典 型性猪痕病毒（ClassicSwineFeverVirus，CSFV)的病毒亚单位。 现有技术
[0003] 典型性猪瘟（CSF)也称为猪霍乱，由于其高传染性特征及其世界范围的分布而 被视为猪中最重要的疾病，并且它被包括在世界动物卫生组织（WorldAnimalHealth Organization)的通报疾病列表中。这种疾病的病原体即CSFV是黄病毒科（Flaviviridae) 的瘟病毒属的病毒。已知它是具有脂质包膜的病毒，其直径为40 - 60nm和呈现六方对称， 并且具有单链核糖核酸（RNA)作为遗传物质（Kummerer等人（2000).Thegeneticbasis forcytopathogenicityofpestviruses.Vet.Microbiol. 77 :117_128;Moenning等人 (2003).ClinicalsignsandepidemiologyofClassicalSwineFever；areviewofnew Knowledge.Vet.Journal165 ： 11-20)〇
[0004] CSF是高度接触传染性的疾病，在其急性形式中呈现出发热、毛细管变性、内脏器 官坏死和死亡。主要临床征象在2 - 6天的潜伏期后出现，最初产生发热、运动减少和食 欲缺乏，这在接下来的时间内变得更糟并且体温可以达到42°C。此外，出现白细胞减少症， 其中白细胞系列（whiteseries)的值小于8000/mm3血液。猪还形成结膜炎、便秘，随后为 在末期中的腹泻、呕吐、缺乏运动协调、抽搐和肌肉轻瘫。在整个腹部、猪口鼻部、耳和腿的 内部部分中扩展的红色肤色是明显的。在大多数致死病例中，脑的组织病理学显示具有高 度血管化的非化胺性脑炎（Moenning等人（2002)ClinicalSignsandEpidemiologyof ClassicalSwineFever.Areviewofnewknowledge.Vet.Journal161 :1-10)〇
[0005]CSFV在感染期间的行为如同免疫抑制剂（Susa等人（1992)Pathogenesisof ClassicalSwineFever：B-lymphocytedeficiencycausedbyHogCholeravirus. J.Virol.66 :1171-1175)，并且在感染后2 - 3周时开始检测到中和抗体（Laevens等人 (1998).Anexperimentalinfectionwithaclassicalswinefevervirusinweaner pigs.II.Theuseofserologicaldatatoestimatethedayofvirusintroduction innaturaloutbreaks.Vet.Q. 20:46-49)。感染的末期与循环系统中以及淋巴组织中B 淋巴细胞显著减少相关联（Susa等人（1992).PathogenesisofClassicalSwineFever: B-lymphocytedeficiencycausedhogcholeravirus.J.Virol. 66 :1171_1175) 〇 大多数 得病的猪在感染后10 - 20天死亡，其死亡率超过95%。CSF特征性的尸检损害属于出血素 质，其中在大多数器官系统中出现瘀斑。这些瘀斑在肾、膀胱和淋巴节中更常见，尽管它们 还可以出现在脾、喉、粘膜和楽J莫中（Mouwen等人（1983)AtlasofVeterinaryPathology， Bunge,UtrechtTheNetherlands)〇
[0006] 经胎盘感染是CSF的其他临床形式；在这种情况下，病毒能够通过怀孕母猪胎盘 感染胎儿。这种感染的后果可以是流产、产出死亡的后代、木乃伊化、畸形、产出虚弱的猪 和在器官分化中的问题。取决于感染出现时的怀孕时间，可以由于通过母猪进行的感染 而生出CSFV免疫耐受性后代（垂直传播）。小猪保持受感染状态和病毒血症直至死亡， 其中导致CSFV散布稳定地集中于该兽群中（Moenning等人（2003)ClinicalSignsand EpidemiologyofClassicalSwineFever：areviewofnewknowledge.Vet.Journal 165 :11-20)。与CSF相关的死亡率构成了受影响国家的经济问题，其中对发展中国家的经 济和社会形势的损害具有影响。由于这些原因，在具有高的猪密度和高的病毒流行的国家 中，必须应用基于疫苗接种的控制计划。在其中猪生产主要由政府以津贴补助的高度发达 的国家例如欧洲、美国和加拿大中，应用通过扑杀进行的根除法。然而，成本是极高的并且 那些国家仍易受可能的地方性动物病的影响。
[0007] 欧盟（EU)被视为这种疾病再度出现的高危地区，这是由于猪群的高密度、不 接种疫苗的政策以及其与东欧国家（在那里CSFV是地方性动物病）在地理学上相接 近。与这个区域中这种疾病再度出现相关的问题之一是存在具有CSF的地方性感染的 野猪（Laddomada(2000)IncidenceandcontrolofCSFinwildboarsinEurope. Vet.Micr〇b，73 :121-30)。这种再度出现已经发生，尽管在欧盟内部实现了一致的控制 计划，其包括整个接触传染性群体的卫生处死和限制猪从受影响地区输出到无病地区 (vanOirschot(2003)VaccinologyofClassicalSwineFever:fromlabtofield.Vet Microbiol，96 :367-384)。因而，当务之急是必需开发诱导早期且安全的免疫应答的疫苗， 其保证针对感染和病毒传播的保护。
[0008] 已开发了基于完整病毒的针对CSFV的疫苗：具有经结晶紫或福尔马林灭活的 病毒的疫苗（Biront等人（1988)Classicalswinefeverrelatedinfections.Liess B.M.Ed.MartinusNijhoffPublishing，Boston: 181-200)，具有通过在兔中进行传代而减 毒的病毒的疫苗，例如Sinlak毒株（Baibikov等人，RU2182495)和LapiniziedChinese 毒株（Dahle等人(1995)Assessmentofsafetyandprotectivevalueofacell culturemodifiedstrainCvaccineofhogcholera/classicalswinefevervirus. Berl-Munch.Tieraztl.Wsch，108 :20-25)，或者具有在兔、豚鼠和猪的细胞培养中进行减 毒的病毒的疫苗（Kachiku等人，JP73001484;Terpstra等人（1990)Developmentand propertiesofacellcultureproducedforhogcholerabasedonChinesestrain. Ditsh.Tierarztl.Wsch. 97 :77-79)。由于可能包含活性病毒的级分，这些类型的疫苗构成 危险，所述活性病毒在易感动物上进行接种后将产生新的CSF爆发。此外，在某些情况下， 需要重复免疫接种以获得保护性免疫应答，因为灭活影响病毒的免疫原性性质。
[0009] 在具有减弱的毒力的活疫苗的特定情况下，它们具有潜在的风险，即发生部分减 毒或毒力回复。在任何一种情况下，它们都将产生致病性病毒颗粒，所述致病性病毒颗粒在 对易感动物接种后允许兽群中CSF的感染、临床疾病和传播。这些问题对怀孕母猪造成更 大的危险，因为该病毒可以感染高度易感的胎儿，并且被感染的后代传播该疾病。
[0010] 存在基于已证实减毒的CSFV毒株的疫苗，如CChinese毒株、PAV250毒 株、Thierval毒株和IFFA/A-49 毒株（Bjdrlund,H.JV?等人（1998)Molecular characterizationofthe3?noncodingregionofclassicalswinefevervirus vaccinestrains.VirusGenes16 :307_312;Launais等人（1978)HogCholeraVirus：ActiveimmunizationofpigletswiththeThivervalstraininthepresenceand absenceofcalostralpassiveimmunity.Vet.Microbiology3 :31-43) 〇这些毒株仅在其 中该疾病是地方性动物病的国家中使用，因为它们具有无法区分已接种疫苗的动物和感染 了天然病毒的动物的不便。用这些毒株进行疫苗接种的动物在血清学测试中产生如同受感 染动物中相同的应答。用基于减毒病毒的疫苗产生的特异性抗CSFV抗体干扰CSF感染的诊 断。所述诊断通过免疫检测在扁桃体中的传染性病毒来进行，而所述疫苗病毒毒株恰恰在 扁桃体中进行增殖。由于这些原因，减毒的毒株不适合在根除计划中使用。用LK-VNIIVVM 毒株进行疫苗接种和用以弗氏佐剂配制的经纯化的Shi-Myng毒株进行另外的超免疫是另 一个例子。但是，在40-45个位置中的免疫接种在其中每天必须对数百只动物进行疫苗接 种的疫苗接种活动中是不可行的（Balashova等人，RU2183972)。
[0011] 用包含完整病毒的这些疫苗进行免疫接种还干扰在由CSFV引起的感染和由可以 感染猪的痕病毒属的其他成员（如牛病毒性腹泻病毒（缩写为BVDV)和边界病病毒（缩 写为BDV))引起的感染之间的区别性诊断（Dahle等人（1991)ClinicalPostMortemand VirologicalFindingsafterSimultaneousInoculationofPigswithHogChol