用于hiv预防和治疗的聚糖修饰的抗-cd4抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般而言涉及HIV和治疗。本发明一般而言还涉及抗体的聚糖修饰。具体 而言，本发明涉及用于HIV预防和治疗的聚糖修饰的抗-CD4抗体。
【背景技术】
[0002] HIV-1藉由病毒包膜（Env)糖蛋白gpl20与T细胞受体⑶4结构域1 (D1)交互作 用的驱使进入体内。Ibalizumab (iMab)是一种有效及广域的HIV-1中和性Ab (Jacobson et al. , Antimicrob. Agents Chemother. 53:450-457,2009 ;Kuritzkes et al. , J. Infect. Dis. 189:286-291，2004)，其主要藉由与宿主T细胞CD4受体结构域2 (D2)结合以中和 HIV，因而阻断HIV利用这些⑶4受体进入T细胞并产生感染的能力（Burkly et al.，J. Immunol. 149:1779-178,1992)。在最近的一大组基础分离株（118株包膜假型病毒）的检 测中，以抑制50%感染为定义时，ibalizumab中和所有病毒的92%，而以抑制90%感染为 定义时，中和47. 4%的病毒。虽然ibalizumab可有效抑制大范围的HIV分离株，但是有明 显一部分的HIV变体仍可逃脱ibalizumab的抑制。近来的报告指出，HIV第一型包膜可变 区5的天门冬酰胺酸连结聚糖化位点的丧失与ibalizumab之抗性有关（Toma et al.，J. Virology 85(8):3872_2880,2011;Pace et al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.出版前 之电子版本：2012年9月）。
[0003] 抗体恒定区之保留位置会被聚糖化，而连接至所述恒定区的聚糖类的存在及结构 可影响抗体的活性（请见 Wright and Morrison, TIBTECH 15:26-32, 1997 之回顾）。
[0004] 有报告指出，以N-连结糖导入重链而非轻链造成改进的溶解度（Pepinsky et al.,Protein Sci 19,954-966,2010 ；ffu,et al.,Protein Eng Des Sel 23, 643-651, 2010)。在Pepinsky之文献中，修饰位于恒定区而非可变区。然而，先前的研 究并未提供策略性地以聚糖置于抗体可变区的功效。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种以轻链可变区的醣修饰增强单克隆抗体活性的新颖方法。在本发 明之各【具体实施方式】中，提供适于生产所述抗体的聚糖修饰的抗-CD4单克隆抗体、表达载 体及细胞株，以及所述抗体在HIV预防和治疗之用途。
[0006] -方面，本发明提供一种聚醣修饰的抗-⑶4抗体，其具有一个或一个以上的N-连 结聚糖类连接至该抗体之可变区。在本发明的一些【具体实施方式】中，该N-连结聚糖类连接 至抗体之轻链可变区。所述聚糖类的连接是经由在该抗体可变区的一个或一个以上的工程 化N-链接聚糖化位点而达成。
[0007] 本发明的一【具体实施方式】中，该聚糖修饰的抗-CD4抗体是一种在可变区具有一 工程化N-链接聚糖化位点的抗-CD4抗体的修饰型。在一些【具体实施方式】中，该工程化 N-链接聚糖化位点位于抗-CD4抗体的轻链可变区，所述抗体诸如ibalizumab之野生型 (WT)或修饰型、ibalizumab突变克隆或抗-⑶4抗体之修饰型。在一些特定的具体实施 方式中，该工程化N-链接聚糖化位点位于ibalizumab轻链的胺基酸位置或其相对应的位 置，所述胺基酸位置选自于由残基30E、52、53、54、60、65、67、76及其组合所组成之群组。在 本发明中，该聚糖化位点位于选自由30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、67Ser及 76Ser所组成群组之胺基酸位置。在一些实施方式中，该位于30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、 65Ser或67Ser之聚糖化位点提供改进的活性。在本发明的一具体实方式中，该聚糖化位点 位于位置52Ser。
[0008] 本发明的一特定实施方式中，该抗-⑶4抗体为ibalizumab之修饰型，其包含在轻 链可变区一工程化N-链接聚糖化位点。
[0009] 本发明之另一特定实方式中，该聚糖修饰的抗-CD4抗体为MV1之修饰型，其包含 在轻链可变区一工程化N-链接聚糖化位点。
[0010] 本发明之一具体实方式提供一聚糖修饰的抗-CD4抗体，称作LM52,所述抗体是以 制备成具有⑶4 (抗-⑶4IgG 1抗体）亲和性的IgG 1抗体，并在位置52导入N-链接聚糖 而修饰。
[0011] 本发明之另一具体实方式中，提供一种具有改进抗体再利用性（recycling)的聚 糖修饰的抗-CD4抗体，其具有如SEQ ID N0:4所述的轻链胺基酸序列，以及具有如SEQ ID N0:5所述的重链胺基酸序列。
[0012] -些【具体实施方式】中，该连接至抗体之N-连结聚糖类是由至少7个糖单元组成。 在其他【具体实施方式】中，该N-连结聚糖类是由10至11个糖单元组成。
[0013] 本发明的其他【具体实施方式】中，提供表达载体及宿主细胞，其适合用于表达在可 变区具有一工程化N-链接聚糖化位点的抗-CD4免疫球蛋白链。
[0014]另一方面，本发明提供一种具有改进活性的聚糖修饰的单克隆抗体，其中该聚糖 修饰的抗-CD4抗体具有如前面所定义连接的可变区的N-连结聚糖类。本发明的抗体或 抗原结合片段有效抑制、治疗或/及预防标的细胞免于受人类免疫缺乏病毒第一型（human immunodeficiency virus type 1，「HIV_1」）的感染。
[0015] 又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含一治疗有效量的本发明的聚糖修 饰的抗-CD4抗体及至少一药学上可接受的载体。
[0016] 又另一方面，本发明提供一种用于抑制、治疗及/或预防HIV感染及传输的方法， 其包含将一药物组合物给药于一有需求的个体，其药物组合物包含一治疗有效量的本发明 的聚糖修饰的抗-CD4抗体及至少一药学上可接的受载体。
[0017] 最后方面，本发明提供一种具有改进活性的聚糖修饰的单克隆抗体，其包含连接 至该抗体可变区的N-连结聚糖类，具体而言是该抗体的轻链可变区。
【附图说明】
[0018] 本发明的前述摘要及下列详尽说明将因配合附图阅读而能有更佳的理解。为了阐 释本发明，图式【具体实施方式】中所示的内容为优选的呈现。然而，应理解的是，本发明未局 限于那些【具体实施方式】。
[0019] 在图式中：
[0020] 图1显示与Ibalizumab抗性相关联的V5潜在性N-连结聚糖化位点（potential N-linked glycosylation sites，PNGS)的数目（横条代表中位数）。
[0021] 图2显示V5 N端PNGS的缺少赋予HIV具有ibalizumab抗性。
[0022] 图3显示V5 N端PNGS导入后对于HIV的ibalizumab敏感性的影响。
[0023] 图4提供一图像显示所描绘的ibalizumab-⑶4复合体的晶体结构，其显示数个 ibalizumab轻链的胺基酸位置是基于与gpl20 V5的接近距离进行突变以导入一N-连结聚 糖化位点。
[0024] 图5提供HIV_lgpl20 V5之糖基化模型，其结合于CD4及ibalizumab (使用 PyMOL);其中该复合体模型是藉由CD4之D1与D2结合于gpl20结构（蛋白质数据库登录号 2NXY)及⑶4结合于ibalizumab的相同结构域（PDB 302D)的重迭而产生；以及藉由相对应 之天门冬酰胺酸与取自3TYG之糖结合型天门冬酰胺酸之重迭而将糖（蓝色）导入天 门冬酰胺酸；以及ibalizumab的重链及轻链分别以青绿色及洋红色条带表示。人类⑶4的 前两个结构域为绿色，而HIV-lgpl20为棕褐色；其中图5A显示Man 5GlcNac2位于gpl20 V5 环状结构（N端）之位置459 ;以及图5B显示Man5GlcNac2位于gpl20 V5环状结构（C端） 之位置463。
[0025] 图6A-6D显示ibalizumab轻链（L链）之N-连结聚糖化，其中：
[0026]图6A显不该构建的ibalizumab L链突变体（LMs)、与WT ibalizumab重链（H 链）质粒共同转染至293A细胞、在蛋白质-A琼脂糖管柱纯化，以及藉由SDS-PAGE分析（WT ibalizumab以相同方法分析）。
[0027] 图6B显示在变性条件下使用或不使用PNGase F处理的纯化的WT、LM30E、LM53与 LM52抗体，并以SDS-PAGE分析。
[0028] 图6C显示产生于293A细胞中LM52L链上N-连结糖基的质谱分析。
[0029] 图6D显示于聚糖类大小与中和活性之间所观察到的正相关。
[0030] 图7显不WT ibalizumab及其LMs之中和活性；其中对于一组ibalizumab抗性或 部分ibalizumab抗性假型病毒株或具复制能力的HIV-1病毒株的中和作用是以TZM-bl试 验所测定；96USHIPs9、BK132/GS009 与 96USHIPs7 是具复制能力的病毒株；CAAN5342. A2-dd 与AC10. 0. 29-dd为V5中不具任何PNGS的定点包膜突变体并对于野生型ibalizumab的中 和作用具有抗性或部分抗性；9015-07A1与1051-D927为B分支传染型初始传播病毒（数 据代表三次独立实验）。
[0031] 图8A-8C显示聚糖大小对于LM52之HIV-1中和活性的影响，其中：
[0032] 图 8A 显示 LM52 在具有或不具衣霉素（tunicamycin) (m52-T)或 kifunensine(m52-K) 的HEK293A细胞中产生；或者，U52在N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I阴性GnT 1㈠HE K29 3 S细 胞（LM52-G)中产生；该纯化的LM52蛋白质以及未修饰的LM52及WT ibal izumab是由 SDS-PAGE 分析。
[0033] 图8B显示ibalizumab及LM52之不同聚糖变体对于三种ibalizumab抗性假型病 毒的和活性，如TZM-bl细胞所测定。
[0034] 图8C显示当标记在ibalizumab的残基52时，空间的描绘（使用PyMOL)是由糖类 之代表性构象及大小所填充。根据图5产生之模型进行描绘且颜色一致；其中该7环N-糖 Man 5GlcNac2取自 PDB 登录号 3TYG。11 环 N-糖 Man 3GlcNac5Fuc 取自 PDB 登录号 3QUM(所 述结果代表三次独立实验）。
[0035] 图9显示一组118株HIV-1套膜假型病毒的中和作用；其中LM52与WT ibalizumab 的中和作用是以TZM-bl试验所测定；其中针对每株病毒，当Ab之测试浓度达到10 y g/ mL时，黑色条带代表最大抑制百分比（maximum percent inhibition，MPI)，及相对应之 IC5Q( y g/mL)或ICS(]( y g/mL);病毒是以ibalizumab之MPI递减顺序排列；基于庞大的病 毒数量，本实验仅进行一次。
[0036] 图 10 显示 LM52 之 HIV-1 病毒株覆盖率。WT ibalizumab、LM52,以及 PG9、10E8、 VRC01与NIH45-46G54W HIV-lmAb的病毒覆盖率。LM52及ibalizumab的检测浓度达到 10 y g/mL，而其他单克隆抗体的检测浓度达到50 y g/mL。
[0037] 图11提供LM52及ibalizumab对于一组118株不同HIV-1包膜假型病毒的中和 活性的摘录，并以其IC 5(：( y g/mL)与ICS(]( y g/mL)表示；其中红线代表几何平均值及95% 信赖区间（每个点代表个别的病毒株）。
[0038] 图12显不LM52和ibalizumab对于ibalizumab敏感性或ibalizumab抗性病毒 的IC S。值（抗性之定义为1C 8。>10 y g/mL)。
[0039] 图13A显示ibalizumab H链与L链的大小及其单、双与三糖变体的SDS-PAGE分 析。
[0040] 图13B显示在TZM-bl细胞中ibalizumab、LM52及数个双或三糖突变体对于两个 ibalizumab抗性假型病毒的中和活性。
[0041] 图14A和14B提供LM52多重反应性（polyreactivity)的分析结果，其中：
[0042] 图 14A 显不 LM52 及 ibalizumab 之