治疗RA的药物及18β-GA的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及类风湿关节炎的治疗领域，尤其涉及治疗RA的药物及18 β-GA的应 用。
【背景技术】
[0002] 类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA)是最常见的全身性自身免疫疾病 之一，以慢性、进行性、侵蚀性、对称性的多关节炎为主要表现，其病理特点包括滑膜异常增 生、炎症浸润和血管翳生成，继而可造成关节骨质的破坏，导致关节畸形和功能丧失。尽管 RA的临床指南不断更新和优化，治疗手段愈加丰富，但仍有部分患者未能控制病情。而且大 多治疗RA的药物具有非常明显的不良反应，如胃溃疡、感染、心肌梗塞、肝肾损伤等。因此 需进一步深入研究RA的发病机制，寻找新的治疗靶点和方向，研发新的药物以满足RA患者 的需要。
[0003] 甘草（Glycyrrhiza uralensis)又名乌拉尔甘草，是一种补益中草药。药用部位 是根及根莖，药材性状根呈圆柱形，长25~100cm，直径0. 6~3. 5cm。天然繁殖，莖挺拔直 立，气微味甜而特殊。功能补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等。甘草酸 是甘草中最主要的活性成分，具有明显的类似糖皮质激素样的抗炎等作用，但是具体作用 机制和途径仍不清楚。甘草酸及其系列产品，对肉瘤、癌细胞生长有抑制作用，对艾滋病的 抑制率高达90 %，有较强的增加人体免疫功能作用。
[0004] 18 β -甘草次酸（18 β -GA)是甘草酸在水解后的产物，其分子式为C3()H4604，分子量 为470. 68,结构式如下：
[0006] 甘草在中药中主要是作为调和之药来使用的，很少作为主要用药。而来源于甘草 的18 β -GA也是如此。且现有对18 β -GA的研究主要集中在其具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤 作用方面，还没有18 β-GA作为主药治疗RA的报道。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种治疗RA的药物及18 β -GA的应用。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种治疗RA的药物，其有效成分为18 β -GA。
[0010] 优选地，所述治疗RA的药物还可以含有药用辅料。药用辅料包括表面活性剂、润 滑剂、崩解剂、防腐剂、矫味剂、色素等。
[0011] 优选地，所述治疗RA的药物可以制备成口服制剂或注射剂等多种剂型。口服制剂 可以是片剂（包括普通片、分散片、缓释片、控释片、口腔崩解片、含片）、丸剂、粉末混合物、 颗粒剂、胶囊剂、包衣剂、溶液、乳剂、分散剂，也可以用注射剂、栓剂或其它适宜的形式。这 些制剂按照本领域的技术人员熟知的方法制备。如制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是 常规的辅料，例如淀粉，明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如水、乙醇、丙 二醇，植物油类如玉米油、花生油、橄榄油等。
[0012] 本发明还提供18 β-GA的用途，其具有如下用途：
[0013] 18 β -GA在制备治疗RA的药物中的应用。
[0014] 18 β -GA在制备治疗滑膜炎药物中的应用。
[0015] 18 β -GA在制备抑制RA滑膜细胞增殖的药物中的应用。
[0016] 18 β -GA在制备诱导RA滑膜细胞凋亡的药物中的应用。
[0017] 18 β -GA在制备阻断RA滑膜细胞细胞周期的药物中的应用。
[0018] 18 β -GA在制备使RA滑膜细胞停留在G1期的药物中的应用。
[0019] 18 β -GA在制备激活F0X〇-3a表达的药物中的应用。
[0020] 18 β -GA在制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。
[0021] 18 β -GA在制备抑制TxA2自我激活通路的药物中的应用。
[0022] 18 β -GA在制备抑制NF- κ B1表达的药物中的应用。
[0023] 18 β -GA在制备下调TxAS表达的药物中的应用。
[0024] 18 β -GA在制备下调C0X-2表达的药物中的应用。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0026] 1、本发明使用的是明确的单体18 β -GA，不仅观察到18 β -GA具有抑制细胞增殖， 促凋亡的现象，而且还深入研究并初步阐明其相应的分子机制，明确药物的具体作用靶点。
[0027] 2、18 β -GA具有抑制RA细胞活性和增殖的作用，随着浓度和时间的延长其抑制作 用更强。细胞凋亡和细胞周期实验进一步发现18 β -GA可抑制ΜΗ7Α进入S期，停留在G1 期而阻滞细胞周期循环，从而导致细胞凋亡。该结果直接表明18 β-GA可通过干扰细胞周 期发挥对细胞生长的影响。
[0028] 3、18 β -GA在200-300 μ Μ浓度时均能有效提高p-Fox03a的表达，激活相关通路， 同时也发现p_Fox03a的活化主要是由于18 β -GA抑制Akt磷酸化而导致的。该结果不仅 初步揭示了 18 β -GA抑制细胞生长的机制，而且也提示Akt/FoxO通路是影响滑膜细胞异常 增殖的病理机制之一。
[0029] 4、本发明首次证实在RA滑膜细胞中，18 β -GA可发挥抑制TxA2自我激活通路的作 用。且发现18 β -GA主要通过抑制NF- κ B1 (p50)而下调TxAS和C0X-2的表达，进而发挥 抗炎和抗增殖作用。
【附图说明】
[0030] 图1为MTT法检测细胞增殖结果图。其中，表示与C0N(正常对照组）相比P < 0.05，"#"表示与C0N(正常对照组）相比P < 0.01，"#*"表示与C0N(正常对照组） 相比Ρ<〇·〇〇1 表示与TNF-α组（模型组）相比Ρ<〇·〇5，"##"表示与TNF-α组 (模型组）相比P < 0.01，"###"表示与TNF-a组（模型组）相比P < 〇.〇〇1。
[0031 ] 图2为细胞周期及细胞凋亡检测结果图。其中，图2A为细胞凋亡流式检测结果图， 图2B为细胞周期流式检测结果图。图中Control为对照组，TNF-α (lOOng/mL)为模型组， 18 β -GA (200 μ M)为用 200 μ Μ 的 18 β -GA 刺激的实验组，18 β -GA (300 μ M)为用 300 μ Μ 的 18 β -GA刺激的实验组。
[0032] 图 3 为 p-F0X0_3a 和 p-Akt 表达的 Western Blot 结果图。图 3A 为 p-F0X0_3a 表达的Western Blot结果图，图3C为p-F0X0-3a表达水平柱状图，图3B为p-Akt表达的 Western Blot结果图，图3D为p-Akt表达水平柱状图。其中，表示与C0N(正常对照 组）相比P <〇· 05，"#"表示与C0N(正常对照组）相比P <0· 01，"*#"表示与C0N(正 常对照组）相比P < 0.001。
[0033] 图4为18 β -GA对TxA2自我激活通路调控影响结果图。图4A为NF- κ B、C0X-2 以及TxAS表达的Western Blot结果图，图4C为NF- κ B、C0X-2以及TxAS表达柱状图，图 4B为NF- κ B1在胞核中的表达情况图，图4D为NF- κ B1在胞浆中的表达情况图。
[0034] 图5为信号通路图。
【具体实施方式】
[0035] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和【具体实施方式】做进一步说明。本实发明 中使用的试剂、仪器等都是市售产品，使用的检测方法等都是本领域技术人员所熟知的，在 此不再赘述。
[0036] 本发明中主要细胞、试剂、仪器的来源如下：
[0037] RA关节滑膜细胞株MH7A购自日本理化学研究所RIKEN生物资源中心（http :// www. brc. riken. jp/lab/cell/English/)。MH7A 是由 RA 患者的滑膜成纤维细胞经 SV40T 抗 原基因转染后转化而成的永生化细胞株。
[0038] 血检素合酶（Thromboxane synthase，TxAS)和血检素受体（Thromboxane receptor，TP)双重抑制剂 BM567 购买自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA) 〇 细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购自凯基生物技术公司，相应的流式细胞仪为 Becton, Dickinson and Company 产品；抗 p-Akt (ser473)抗体、抗 C0X-2 抗体、抗 NF-kBI 抗体、抗NF-kB2抗体、抗pF0X〇-3a抗体均购自 Cell Signaling Technology，抗TxAS抗体 购自美国 Origene，抗 GAPDH 抗体购买自 Santa Cruz Biotechnology。
[0039] 用于细胞培养的试剂：胎牛血清、双抗（IX 10U/L青霉素和100mg/L链霉素）和 DMEM培养基均为Gibco生产；用于细胞消化传代的胰蛋白酶（含EDTA)购自HyClone ;肿瘤 坏死因子 α (Tumor necrosis factor α，TNF-α)为 R&D Systems 产品。
[0040] 实施例1、细胞增殖检测
[0041] S1、培养MH7A细胞：MH7A细胞株培养于含10%胎牛血清、10U/L青霉素和100mg/ L链霉素的DMEM完全培养基中。每2-3天更换培养液，经3天培养后细胞可覆盖约90%培 养皿，此时用含0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的消化液消化，按1 :3比例传代。
[0042] S2、加药干预：MH7A细胞以每孔2X 105个种6孔板，并加入100ng/mL TNF- α刺 激细胞以模拟RA患者关节滑膜组织微环境。细胞种板后置于37°C、5% 0)2培养箱中，经 24h待细胞贴板后设置