脱氧异醌环素b在制备抗菌药物中应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从海洋小单孢菌Micromonospora sp. TP-A0468的发酵液中提取得到 的脱氧异醌环素 B(精制品）及其制备方法，以及该活性提取物在制备抑菌药品、保健食品 或日化用品的用途，属于药用天然产物领域或保健食品、日化用品制造业。 2、
【背景技术】
[0002] 越野他汀（kosinostatin)及其异构体异醌环素 B(isoquinocycline B)是由海 洋小单孢菌Micromonospora sp. TP-A0468产生的具有良好抗菌抗肿瘤活性的蒽环类化合 物。这类化合物由II型聚酮合酶合成，具有7, 8, 9, 10-四氢-5, 12-蒽醌的骨架结构，并常 常通过不同的糖基化修饰形成种类多样的活性天然产物。研究表明，来源于不同放线菌的 约两百种蒽环类化合物及其通过生物转化、化学修饰等方法获得的约两千种类似物中大多 具有良好的抗肿瘤活性，其中不乏一线的肿瘤治疗药物，如daunomycin和adriamycin(或 doxorubicin)。因此，新的蒽环类化合物的发现对于抗菌、抗肿瘤药物的筛选具有重要意 义。
[0003] 糖基化后修饰是很多天然产物都具有的普遍特征，这些高度修饰的糖基通常参与 药物与细胞靶体之间的相互作用，对于化合物的生物活性具有重要意义。因此，人们对于 天然产物糖基改造的尝试一直在进行，如Walsh和Nicolaou课题组都曾报道使用化学方 法糖基化的策略将非天然的糖基连在vancomycin的糖苷配基上而产生新的类似物；另外， 带有单糖的Idarubicin和epirubicin已经作为抗肿瘤药物投入临床使用，带有二糖的 MEN10775也在临床试验中。然而，由于化学糖基化策略本身的局限性，利用酶学方法达到同 样的目的成为一个更好的选择。本文报道的新天然产物脱氧异醌环素 B (脱氧异醌环素 B)， 其主体结构与越野他汀、异醌环素 B类似，但是糖基单元却不同。因此，该化合物的发现，为 修饰改造蒽环类化合物提供了一个新的糖基来源。体外活性实验也显示，与越野他汀和异 醌环素 B相比，糖基结构的改变的确对化合物的生物活性产生了显著影响。此外，对该化合 物结构的鉴定还间接导致我们发现越野他汀生物合成途径中的KstD5是一个底物容忍性 好的糖基转移酶。这两个独特的糖基单元及其对应的糖基转移酶为我们通过酶促反应对感 兴趣的蒽环类天然产物分子进行糖基替换提供了一种新的选择。
[0004] 本发明从Micromonospora sp. TP-A0468基因敲除突变株中分离得到的越野他汀 生物合成途径的副产物一一脱氧异醌环素 B，结构解析证明该化合物是糖基单元C-3"位置 上羟基缺失的异醌环素 B类似物。本发明通过多种活性筛选实验发现脱氧异醌环素 B具有 很好的抗菌作用。 3、
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于从海洋小单孢菌Micromonospora sp. TP-A0468的发酵液中提 取具有生物活性的精制品，作为抗菌的药物、保健品和日化用品，寻找最适剂量，减少服用 量且得到显著的治疗效果，以提供一种脱氧异醌环素 B制备抗菌的药品、保健食品或日化 用品的方法和用途。
[0006] 采用制备药品、保健品及日化用品的常规方法，将脱氧异醌环素 B制备成各种制 剂，例如片剂、喷雾剂、洗手液、沐浴露、浴足剂、洗发乳及按摩膏等。通过上述方法制备的脱 氧异醌环素 B在抗菌方面有显著的效果。通过本发明方法得到的脱氧异醌环素 B，方法简 单，生产成本低，产品中有效成分含量较高，质量稳定、易于控制。
[0007] 为了确定脱氧异醌环素 B的结构，我们对突变株mK0SD3进行了大量发酵。发酵粗 提物经过数次硅胶柱层析分离，最终从100L发酵液中得到50mg脱氧异醌环素 B。
[0008] 脱氧异醌环素 B :深黄色固体。易溶于二甲亚砜和甲醇，微溶于二氯甲烷和乙酸乙 酯。UV(MeOH) Xmax:430,290,260,228nm;+126.1(c 0.033，Me0H) ;ESI-MS 显示准分子离子 峰 m/z 601.5[M+H]+，HRES頂S m/z 601.2175[M+H] + (C33H33N209cal.601.2181)，从而得到脱 氧异醌环素 B的分子式为C33H32N209。通过4 NMR，13C NMR，HSQC，HMBC，COSY及N0ESY等波 谱数据确定脱氧异醌环素 B的结构。
[0010] 有益效果：提供了脱氧异醌环素 B的新用途。以脱氧异醌环素 B为原料制备成洗 面奶，沐浴露，浴足剂，洗发乳，按摩膏等，具有滋润，营养肌肤，收缩毛孔，抗衰老，养颜以及 香体，促进微循环的作用。 四、【具体实施方式】：
[0011] 实施例1
[0012] LB培养基:用于大肠杆菌的细胞增殖和阳性克隆子的筛选。蛋白胨1.0,酵 母提取物〇· 5和NaCl 1. 0, ρΗ7· 0。固体培养加入琼脂2. 0。Seed culture培养基: 用于Micromonospora sp. TP-A0468野生型及突变株的培养。可溶性淀粉1. 0,葡萄糖0. 5， NZ-case plus 0· 3,酵母提取物 0· 2,胰化蛋白胨 0· 5, Κ2ΗΡ04 0· 1，MgS04 0· 05, CaC03 0· 3， pH = 7.0。发酵培养基（％ ):用于Micromonospora sp.TP_A0468野生型及突变株的发 酵培养。乳糖 4.0,棉轩粉 2.0。IWL-4 培养基（％):用于 Micromonospora sp.TP_A0468 和 Ε· coli S17-1 的属间接合转移。可溶性淀粉 L 0, Κ2ΗΡ04 (λ 1，MgS04 (λ 1，NaCl 0· 1， (NH4)2S04 0 . 2, CaC03 0.2, FeS04 0 . 0001，MnCl2.6H20 0.0001，ZnS04 0 . 0001，酵母提取物 0. 05,蛋白胨0. 1，琼脂2. 0，ρΗ = 7. 2。挑取突变株mK0SD#PmK0SD5单克隆接种到3mL seed cultural培养基中，30°C 240rpm培养2-3d至培养物呈现亮橙色。转接2%到50mL发酵培 养基中，30°C 220rpm培养1. 5天后加入质量比4%的HP-20,继续培养2. 5天至发酵结束。
[0013] 转移发酵液到50mL离心管中，3800rpm离心10min ;弃上清，沉淀（主要为吸附有 化合物的HP-20)加入40mL丙酮，超声lOmin促溶。3800rpm离心10min，弃沉淀。上清转 移到圆底烧瓶，低温旋蒸至残留少量水溶液。加入乙酸乙酯萃取1-2次，合并乙酸乙酯萃取 液，旋蒸至完全干燥，用约2mL甲醇溶解。取少量作HPLC分析用，其余提取液低温旋干保存 于-20°C。将处理后的发酵浸膏用100-200目硅胶柱层析分离，洗脱剂为甲醇-氯仿，梯度 洗脱。当洗脱剂比例为（甲醇：氯仿）1:25时即得目标化合物。取少量纯品溶于甲醇，用 于HPLC检测。NMR溶剂用DMS0-d6。
[0014] 脱氧异醌环素 B :深黄色固体。易溶于二甲亚砜和甲醇，微溶于二氯甲烷和乙酸乙 酯。UV(MeOH) Xmax:430,290,260,228nm;+126.1(c 0.033，Me0H) ;ESI-MS 显示准分子离子 峰111/2 601.5[]\1+!1]+，!11?5頂5 111/2 601.2175[]\1+!1] + (〇33!133吧09。31.601.2181)，从而得到 脱氧异醌环素 B 的分子式为 C33H32N209。通过 1H NMR，13C NMR，HSQC，HMBC，COSY&NOESY 等波谱数据确定脱氧异醌环素 B的结构。
[0016] 脱氧异醌环素 B
[0017] 实施例2
[0018] 琼脂扩散法测定抑菌圈实验
[0019] 供试病原菌：G+:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus allreus)，G :大肠杆菌 (Escherichia coli)，沙门氏菌。菌株活化后，用无菌水校正至0. 5麦氏比池单位，作为供试 菌液。用灭菌棉签蘸取供试菌液，均匀涂布于MH琼脂平板上，用记号笔在平板底部将平板 划分成四等分，用直径6_打孔器在每份中央打孔，去除孔内琼脂。提取物样品用少量二甲 基亚砜溶解后加于孔中，以满而不溢为宜并作好标记，同时以金银花提取物作为阳性对照， MH肉汤作为阴性对照。37°C培养18~24h，观察有无抑