基于dc的神经胶质瘤治疗性疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种基于DC的神经胶质瘤治疗 性疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内 肿瘤的40-50%，以发病率高、复发率高、致死率高，成为肿瘤治疗的难题。传统治疗方法主 要是手术和放化疗来提高患者的生存机率。但是位于重要功能区的胶质瘤很难做到全切 除。放射治疗几乎是各型胶质瘤的常规治疗，但疗效评价不一，除髓母细胞瘤对放疗高度敏 感，室管膜瘤中度敏感外，其他类型对放疗均不敏感。化疗药物限于血脑屏障及药物的毒副 作用，疗效尚不肯定。近年来，免疫治疗成为脑胶质瘤继手术、放化疗后的有效治疗手段。与 其他方式联合应用，具体有很强的互补作用，对患者受损的免疫系统能够起到恢复与重建 的独特疗效，从而进一步防止肿瘤的复发和转移。
[0003] 目前，现有技术中存在的神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗及其制备方法，但经 ELISP0T法（固相酶联免疫斑点技术）检测该治疗性疫苗发现激发T细胞分泌IFN-γ的能 力较弱，治疗效果不够显著。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中神经胶质瘤疫苗性状不稳定、免 疫原性较弱、特异性不强等缺陷，提供一种免疫原性及特异性强的基于DC的神经胶质瘤治 疗性疫苗。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种基于DC的神经胶质瘤治 疗性疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0006] 获取未成熟DC ;
[0007] 加入神经胶质瘤抗原多肽与未成熟DC共培养；
[0008] 再加入肿瘤坏死因子-α和白介素或脂多糖继续培养，至DC成熟且负载上神经胶 质瘤抗原多肽。
[0009] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述白介素为 白介素-1。
[0010] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死 因子-α的浓度为l-10ng/ml、白介素-1的浓度为5-15ng/ml、脂多糖的浓度为l-10ng/ml。 [0011] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死 因子- α的浓度为浓度为5ng/ml、白介素-1的浓度为8ng/ml。
[0012] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死 因子- α的浓度为浓度为10ng/ml、白介素-1的浓度为5ng/ml。
[0013] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死 因子-α的浓度为浓度为lng/ml、白介素-1的浓度为15ng/ml。
[0014] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，加入肿瘤坏死 因子-α和白介素或脂多糖后继续培养未成熟DC和神经胶质瘤抗原多肽7-13天。
[0015] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述神经胶质 瘤抗原多肽是由FAT10154 162、FAT10155 163和FAT10 49 57表位肽基因重组表达载体的复合物。
[0016] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述 FAT10154 162、FAT10155 163、FAT1049 57表位肽的摩尔比为 1 :1 :1〇
[0017] 在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的制备方法中，所述神经胶质 瘤抗原多肽与未成熟DC在含有粒-巨噬细胞因子和白介素-4的培养基上进行共培养。
[0018] 本发明还提供一种基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗，由上述基于DC的神经胶质 瘤治疗性疫苗制备方法所获得。
[0019] 实施本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗及其制备方法，可以达到以 下有益效果：通过本发明获得的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗不仅性状较稳定，而且免 疫原性及特异性较强，能够很好的调节神经胶质瘤的机体免疫机制，改善神经胶质瘤引起 的肝脏免疫耐受的现象。
【附图说明】
[0020] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0021] 图1为通过蛋白质印迹法检测出的本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫 苗所表达的蛋白。
【具体实施方式】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0023] 本发明提供的一种基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗，其制备方法包括以下步骤：
[0024] (1)获取未成熟DC ;
[0025] (2)加入神经胶质瘤抗原多肽与未成熟DC共培养；
[0026] (3)再加入肿瘤坏死因子-α和白介素或脂多糖继续培养7-13天，至DC成熟且 DC负载上神经胶质瘤抗原多肽。
[0027] 步骤（1)中，未成熟DC可来源于人体血液，但由于未成熟DC在血液中仅占单核细 胞总数的〇. 5-1. 0%，数量很少；因此，本发明优选实施例中，采取诱导单核细胞的方式获 取未成熟DC，具体步骤为：
[0028] (11)从血液中分离出单核细胞；
[0029] (12)再加入体外诱导培养液培养72h，对步骤（11)中获得的单核细胞进行扩增；
[0030] (13)用体外诱导培养液进行半量换液，并将步骤（12)中扩增后的单核细胞定向 诱导分化成树突状细胞。
[0031] 在步骤（11)中，单核细胞可以为CD34+和/或CD14+单核细胞，其中，CD34 +单核细 胞可以从骨髓、脐带血或脾脏等分离得到；CD14+细胞从人外周血分离得到的。由于从脐带 血中纯化出CD34+单核细胞费用昂贵；骨髓采集不易，而且容易污染，患者比较痛苦，扩增费 用昂贵；而脾脏来源受限等使得CD34+单核细胞获取较困难；因此，在本发明中，优选采用 从人外周新鲜血液中分离筛选出CD14+单核细胞，从新鲜血液中获取，相比经过冷库储存或 者培养传代之后的CD14+单核细胞，从新鲜血液中提取的CD14 +单核细胞离体时间不长，其 细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于获取DC。
[0032] ⑶14+单核细胞从人外周血分离的过程为：
[0033] 取人外周血20ml,用Ficon淋巴细胞分离液并根据Ficon淋巴细胞分离液使用说 明书分离出CD14+单核细胞，PBS溶液洗涤后按2. 5-5x10 7/3ml/孔接种于六孔板中，并用 RPMI-1640培养基（RPMI实验室出产的批号为1640的培养基）于37°C，5% 0)2条件下放 置培养90分钟，收集贴壁细胞即CD14+单核细胞。
[0034] 步骤（12)和步骤（13)中的体外诱导培养液优选为适宜于DC生长的含10%胎牛 血清、粒-巨噬细胞和白介素-4的RPMI-1640培养基。需要特别注意的是，由于DC相比非 贴壁细胞其能具有贴壁性，但是其贴壁性能并不强，而是偏向于半贴壁的类型，因此在步骤 (13)的培养的过程中需采用半量换液，以避免将目的DC吹成悬浮而流失。
[0035] 当然可以理解的是，本发明获得未成熟DC的途径也并不局限于此，通过现有技术 中的诱导方法诱导单核细胞获得的未成熟DC同样适用于本发明。
[0036] 在步骤（2)中，优选地，采用含有粒-巨噬细胞因子和白介素-4的培养基上进行 DC与神经胶质瘤抗原多肽的共培养。由于DC有簇状生长的习惯，浓度太高，集结成团，位于 中心的DC不易成熟，影响神经胶质瘤抗原的负载，从而影响疫苗的免疫效果，因此，DC浓度 不易过高，在该步骤中，待未成熟DC在培养基中的浓度小于或等于5 X 105个/ml或将步骤 (1)获得未成熟DC的浓度调整为小于或等于5 X 105个/ml时，加入神经胶质瘤抗原多肽进 行预负载。
[0037] 由于未成熟DC表达能介导DC摄取抗原的一些膜受体如Fc受体，因而相比成熟 DC拥有更强的抗原摄取、加工和处理能力，因此，步骤（2)中利用未成熟DC与神经胶质瘤抗 原多肽共培养能够实现神经胶质瘤抗原多肽的预负载，促进提高神经胶质瘤抗原多肽负载 量，同时，未成熟DC经抗原致敏