用于浓缩多肽的方法
【专利说明】用于浓缩多肽的方法
[0001] 本申请是申请号为200780011523.4、申请日为2007年4月4日、发明名称为 "用于浓缩多肽的方法"的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/ DK2007/000177的国家阶段申请，该国际申请要求申请日分别为2006年4月4日和2006年 7月5日，申请号分别为PA200600488和PA200600922的丹麦申请的优先权。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于浓缩感兴趣多肽的方法，涉及包含浓缩感兴趣多肽的组合物作为 用于皮下注射的药物的用途并且涉及包含至少l〇mg/ml感兴趣多肽的组合物。
[0003] 发明背景
[0004] -些多肽用作药物以预防和/或治疗某些疾病。皮下注射药物的能力是一种优 势，因为这使得患者容易自己施用该药物。
[0005] 由于对有可能皮下注射多大体积存在生理限制（physiological restrain)，因此 对于皮下施用的药物而言，有利的是它们以高浓度可获得，以确保患者接受足量药物和/ 或避免多次皮下注射。
[0006] W0 99/37325公开了治疗和预防由属于血红素生物合成途径的酶的活性缺乏或缺 陷所致疾病的方法。W0 03/002731公开了用于工业规模地纯化重组胆色素原脱氨酶的方 法，并涉及所述纯化产物用于制备药物的用途。类似地，W0 02/099092和W0 2005/094874 提供了溶酶体α-甘露糖苷酶及其治疗性用途。最后，W0 2005/073367提供用于纯化芳基 硫酸酯酶Α的方法和该酶在治疗异染性脑白质营养不良中的用途。
[0007] 本发明涉及用于浓缩感兴趣多肽的方法，并且涉及包含浓缩感兴趣多肽的组合物 在制备用于皮下注射至哺乳动物的药物中的用途。
【发明内容】
[0008] 本发明在一个方面涉及浓缩包含感兴趣多肽的组合物的方法，其包括：
[0009] a)离心和/或过滤包含感兴趣多肽的组合物，
[0010] b)分别浓缩从步骤a)获得的上清液或存留物。
[0011] 在另一个方面，本发明涉及包含至少10mg/ml感兴趣多肽的组合物。
[0012] 在又一个方面，本发明涉及包含75-250mg/ml感兴趣多肽的组合物在制备用于皮 下注射至哺乳动物的药物中的用途。
[0013] 在又一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物急性间歇性卟啉病的方法，其包括皮下 注射含500-300mg/ml PB⑶的组合物。
[0014] 在又一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物异染性脑白质营养不良的方法，其包括 皮下注射含50-300mg/ml芳基硫酸酯酶A(Aryl sulfatase A)的组合物。
[0015] 在又一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物溶酶体贮积病α -甘露糖苷过多症的方 法，皮下注射50-300mg/ml溶酶体α -甘露糖苷酶的组合物。
[0016] 在又一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物克拉伯病的方法，其包括皮下注射含 50-300mg/ml半乳糖基脑苷脂酶（galactosycerebrosidase)的组合物。
[0017] 定义
[0018] 为本发明的目的，序列的比对和同源性记分的计算可以使用可用于蛋白质比对和 DNA比对的完全Smith-Waterman比对法进行。默认记分矩阵BL0SUM50和同一性矩阵分别用 于蛋白质比对和DNA比对。缺口（gap)中第一残基的罚分对于蛋白质是-12并且对于DNA 是-16,而缺口中额外残基的罚分对于蛋白质是-2并且对于DNA是-4。比对可以用FASTA 软件包v20u6版本（W. R. Pearson和D. J. Lipman (1988)，〃用于生物序列分析的改良工具〃， 美国国家科学院院刊（PNAS) 85:2444-2448 和 W. R. Pearson (1990) 〃 用 FASTP 和 FASTA 的快 速而敏感的序列比对〃，酶学中的方法（Methods in Enzymology)，183:63-98)进行。
[0019] 蛋白质序列的多重比对可以使用〃ClustalW〃 (Thompson，J. D.，Higgins，D. G.和 Gibson，TJ. (1994)CLUSTAL W:通过序列加权、位置特异性缺口罚分和权重矩阵选择而改良 进行性多重序列比对法的敏感性。核酸研究（Nucleic Acids Research) ,22:4673-4680) 而进行。DNA序列的多重比对可以使用蛋白质比对结果作为模板，以来自DNA序列的相应密 码子替换氨基酸而进行。
[0020] 在本发明的上下文中，术语〃E. C. 〃（酶分类）指国际认可的酶分类系统，国际生物 化学和分子生物学联合会命名委员会推荐，学术出版社（Academic Press)，Inc。
[0021] 在氨基酸序列（例如蛋白质）或核酸序列的上下文环境下所用的术语"来源"将 理解为意指从其中得到所述序列的生物。该序列可以使用本领域技术人员众所周知的基因 技术方法由另一种生物表达。该序列还包括已经被化学合成的序列。此外，该序列可以包 含细微的改变如密码子优化，即核酸序列中的不影响氨基酸序列的改变。
[0022] 发明详述
[0023] 感兴趣多肽
[0024] 本发明的多肽尤其可以为激素或激素变体（hormone variant)、酶、受体或其部 分、抗体或其部分、变应原或报告分子。感兴趣多肽尤其可以选自酶的六个主要分组之 一，例如氧化还原酶（E. C. 1)、转移酶（E. C. 2)、水解酶（E. C. 3)、裂合酶（E. C. 4)、异构酶 (E.C. 5)或连接酶（E.C. 6)中的酶。在更具体的方面，感兴趣多肽可以是氨肽酶、淀粉酶、 糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移 酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、 α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、葡聚糖酶（mutanase)、氧 化酶、果胶降解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转 谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
[0025] 感兴趣多肽尤其可以是可用作药物的多肽。
[0026] 合适感兴趣多肽的实例包括但不限于选自胆色素原脱氨酶、芳基硫酸酯酶、α -甘 露糖苷酶和半乳糖脑苷脂酶的其中之一的酶。
[0027] 原则上，从任何来源可获得的感兴趣多肽都可以根据本发明方法进行处理。
[0028] 在【具体实施方式】中，感兴趣多肽可以是人源的。尤其在使用感兴趣多肽来制造将 施用至人的药物的情况下，所述多肽可以是人源的，因为这可以使不希望有的变态反应的 风险最小化。术语"人类来源"在本发明上下文中包括例如因多态性所致的人多肽的天然 变异。
[0029] 感兴趣多肽尤其可以作为重组蛋白进行生产，即编码感兴趣多肽的核苷酸序列可 以导入用于表达感兴趣多肽的细胞。重组表达可以是同源的或异源的，即感兴趣多肽可以 在天然表达该多肽的细胞中天然地表达（同源性表达）或它可以由不天然表达此多肽的细 胞表达（异源性表达）。
[0030] 重组感兴趣多肽可以由适于重组产生特定感兴趣多肽的任何细胞表达。合适细胞 的实例包括但不限于原核细胞，如大肠杆菌（E. coli)细胞或芽孢杆菌（Bacillus)细胞。合 适的真核细胞的实例包括但不限于酵母细胞或如中国仓鼠卵巢细胞（CH0)的哺乳动物细 胞。备选地，它可以是人细胞。
[0031] 用于表达糖基化多肽的合适宿主细胞得自多细胞生物（multicellular organism)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。然而，宿主细胞也可以是脊 椎动物细胞，并且对培养（组织培养）的脊椎动物细胞增殖已经变成常规方法。
[0032] 术语"重组多肽"或"重组感兴趣多肽"在本文中指重组产生的多肽。
[0033] 对特定感兴趣多肽称谓在本发明的上下文中也包括感兴趣多肽的功能等效部分 或类似物。例如若感兴趣多肽是酶，则该酶的功能等效部分可以是该酶的如此结构域或次 序列（subsequence)，其包括能够产生与全长酶或可选择的编码催化剂的基因基本上相同 的酶活性的必需催化位点。术语"基本上相同的酶活性"指具有至少50%、优选至少60%、 更优选至少70 %、更优选至少75 %、更优选至少80 %、更优选至少85 %、更优选至少90 %、 更优选至少95%和最优选地至少97%、至少98%或至少99%的天然酶活性的等效部分或 类似物。酶的酶学等效类似物的实例可以是包括处于有功能形式下的该酶催化位点的融合 蛋白，不过它也可以是得自另一个物种的该酶的同源变体。另外，模拟相关酶的专一性酶活 性的完全人造分子也构成"酶学等效类似物"。
[0034] 通常，技术人员将能够轻易地设计用于测定酶活性的适宜测定法。然而对于PB⑶， 合适的测定法在W0 03/002731中、在实施例2中及在本申请的实验部分中描述。除其天然 底物之外，芳基硫酸酯酶也能够催化合成性生色底物对-硝基儿茶酚硫酸酯（PNCS)的水 解。对-硝基儿茶酚（PNC)产物吸收在515nm上的光线。用于测定芳基硫酸酯酶活性的测 定法在 W0 2005/073367 并在 Fluharty 等 1978,酶学方法学（Meth. Enzymol) · 50:537-47 中 详述。对于LAMAN，适宜的酶活性测定法在W0 02/099092中公开。
[0035] 3曰色素原脱氨酶
[0036] 在一个实施方式中，本发明的感兴趣多肽可以是胆色素原脱氨酶（又称作胆色素 原氨-裂合酶（聚合作用））即 E. C. 4. 3. 1. 8. ( Waldenstrdm 1937, J. Acta. Med. Scand. Suppl. 8)。胆色素原脱氨酶是血红素生物合成途径中的第三个酶。已经将E. C. 4. 3. 1. 8改 称E. C. 2. 5. 1. 61，因此胆色素原脱氨酶（PB⑶）现在位于这个E. C.编号下。
[0037] 胆色素原脱氨酶催化如此反应：4个胆色素原+H20 =羟甲基胆色烷+4个NH3。
[0038] PBDG与急性间歇性卟啉病（AIP)有重要关系，其中急性间歇性卟啉病是因人类 中PBDG缺乏（活性降低50% )所致的常染色体显性疾病（有关该疾病的其它细节，见 W001/07065)〇
[0039] 胆色素原脱氨酶简称为PB⑶并且这两个术语在本发明的上下文中可以彼此相互 交换地使用。
[0040] 为PB⑶的重组表达，宿主细胞尤其可以是酵母细胞或大肠杆菌细胞。
[0041] 对于构建重组大肠杆菌细胞的详细实例，参考W001/07065的实施例1并且对于构 建能够表达小鼠 PB⑶的重组HeLa细胞和重组NIH 3T3细胞，参考W001/07065的实施例6。
[0042] 术语"重组胆色素原脱氨酶（rPB⑶）"在本文中指重组产生的PB⑶。在下文中，这 种酶及其重组的人PB⑶形式将分别称作"PB⑶"和"rhPB⑶"。在该术语中还包括PB⑶的 酶学等效部分或类似物。该酶的酶学等效部分的一个实例可以是该酶的如此结构域或次序 列，其包括能够产生与全长酶或可选择的编码催化剂的基因基本上相同的酶活性的必需催 化位点。术语"基本上相同的酶活性"指该酶的如此等效部分或类似物，其具有至少50 %、优 选至少60 %、更优选至少70 %、更优选至少75 %、更优选至少80 %、更优选至少85 %、更优 选至少90%、更优选至少95%和最优选至少97%、至少98%或至少99%在W0 03/002731 的实施例2内描述的rhPBGD活性测定法中所测量的天然人rhPBGD活性。该酶的酶学等效 类似物的实例可以是包括处于有功能形式下的该酶催化位点的融合蛋白，不过它也可以是 得自另一个物种的该酶的同源变体。另外，模拟相关酶的专一性酶活性的完全人造性分子 也构成"酶学等效类似物"。
[0043] 可以在本发明中使用的PBGD的实例包括在本申请序列1-10中所示或具有 Genebank编号X04217、X04808或M95623的那些PB⑶的任意一种。
[0044] 在本发明的另一个实施方式中，感兴趣多肽可以是芳基硫酸酯酶 A(Arylsulfatase A)〇
[0045] 芳基硫酸酯酶A催化下列反应：3-硫酸脑苷脂+H20 =脑苷脂+硫酸盐 (sulphate)〇
[0046] 已经从包括人肝脏、胎盘和尿的多种来源中纯化了 ASA。ASA是具有低等电点的酸 性糖蛋白。在大于pH 6. 5,此酶作为分子量大约llOkDa的二聚体存在。ASA发生pH-依赖 性聚合，在pH 4. 5上形成八聚体。在人尿中，该酶由63和54kDa的两个不相同亚基构成。 从人肝脏、胎盘和成纤维细胞中纯化的ASA也由大小略微不同的分子量在55和64kDa之间 变化的两个亚基构成。如同其它溶酶体酶，ASA在膜结合核糖体上作为糖基化前体合成。这 种糖基化前体随后穿过内质网和高尔基体，在其中糖基化前体的N-连接寡糖得到加工，形 成磷酸化及硫酸化的复杂型寡糖（Waheed A等生物化学及生物物理学报（Biochim Biophys Acta). 1985,847, 53-61，Braulke T等生物化学与生物物理学研究通讯（Biochem Biophys Res Commun). 1987,143,178-185)。在正常培养的成纤维细胞中，产生62kDa的前体多肽， 该前体多肽通过甘露糖-6-磷酸受体结合作用而转位（Braulke T等生物化学杂志（J Biol Chem). 1990, 265,6650-6655)至酸性前溶酶体内体（Kelly BM等细胞生物学欧洲杂志（Eur J Cell Bio) 1.1989,48,71-78)。
[0047] 芳基硫酸酯酶A尤其可以是人源的。人ASA信号肽的长度（18个氨基酸）以共有 序列和信号序列的特异性加工位点为基础。因此，对来自推导性人ASA cDNA(EMBL GenBank 登录号J04593和X521151)的信号肽的切割应当在全部细胞中在残基编号18(Ala)之后 进行，产生成熟形式的人ASA。在下文中，重组芳基硫酸酯酶A将缩写成rASA，成熟形式的 芳基硫酸酯酶A(包括成熟形式的人ASA)将称作"mASA"并且成熟的重组人ASA将称作 "mrhASA"。
[0048] -种蛋白质修饰已经在两种真核硫酸酯酶（ASA和芳基硫酸酯酶B(ASB))中确 定，并且这两种真核硫酸酯酶之一来自绿藻即团藻（Volvox carteri) (Schmidt B等细胞 (Cell). 1995,82,271-278, Selmer T 等生物化学欧洲杂志（Eur J Biochem).1996,238， 341-345)。这种修饰导致在已知硫酸酯酶中保守的半胱氨酸残基转化成2-氨基-3-氧代 丙酸残基（Schmidt B等Cell. 1995,82, 271-278)。这种新氨基酸衍生物也识别为〇-甲 酰甘氨酸（FGly)。在得自