Epac直接或间接激动剂与溶瘤病毒的联合应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及Epac直接或间接激动剂与溶瘤病毒的联合应用在治疗肿瘤中的应 用，具体地，涉及一种包含Epac直接或间接激动剂以及溶瘤病毒的药物组合物，包含独立 包装的Epac直接或间接激动剂及独立包装的溶瘤病毒的药品套装，体外生产溶瘤病毒的 方法，以及Epac接或间接激动剂与溶瘤病毒的组合在治疗肿瘤，特别是对所述溶瘤病毒不 敏感的肿瘤中的用途。
【背景技术】
[0002] 肿瘤源于正常细胞中基因和表观遗传学的积累变化，这种改变驱使正常细胞转变 为恶性肿瘤。这个复杂病理变化过程决定了不同肿瘤在发生、维持以及转移中机制的多样 性。目前，手术切除、化疗和放疗是临床治疗肿瘤常用的方法，然而手术切除肿瘤易复发， 放、化疗毒副作用大。15~20%人类的癌症与病毒感染有关，如乙型肝炎病毒（HBV)、丙型 肝炎病毒（HCV)与肝癌、人乳头瘤病毒（HPV)与宫颈癌等。
[0003] 溶瘤病毒（oncolytic virus)是一类靶向性感染并杀伤肿瘤细胞，而不破坏正常 细胞的可复制病毒。溶瘤病毒疗法（oncolytic virotherapy)是一种创新的肿瘤祀向治疗 策略，它利用天然的或经基因工程改造的病毒选择性地感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中复 制，达到靶向性溶解、杀伤肿瘤细胞的作用，但是对正常细胞无害。
[0004] 现在溶瘤病毒治疗主要面临以下两个问题。第一，溶瘤病毒的抗肿瘤谱比较窄：对 溶瘤病毒敏感的肿瘤细胞，伴随着较多的病毒复制；对溶瘤病毒不敏感的肿瘤细胞，伴随着 较少的病毒复制。第二，在体内，随着时间的推移，病毒的复制会受到限制，并缓慢被机体清 除。因此，如何让肿瘤细胞选择性地有效增加溶瘤病毒的复制是迫切需要解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明一方面提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含Epac直接或间接激 动剂和溶瘤病毒。本发明另一方面提供用于治疗肿瘤的药品套装，其包含独立包装的Epac 直接或间接激动剂和独立包装的溶瘤病毒。
[0006] 在一个实施方式中，所述Epac直接或间接激动剂选自cAMP类似物、腺苷酸环化 酶激动剂、磷酸二酯酶抑制剂中的一种或多种的组合。所述cAMP类似物选自双丁酰环磷酸 腺苷（db - cAMP)、8 - (4 -硫代氯苯基）-3'，5' -环磷酸腺苷（8 - CPT - cAMP)、3'，5' - 环硫代磷酸腺苷（Rp - cAMPS)、2' -氧代-(2 -氨乙甲酰基）-3'，5' -环硫代磷酸腺苷 (Rp - 2' - AEC - cAMPS/Rp - 2' - EDA - cAMPS)、8 - (6 -己二胺基）-3'，5' -环硫代磷酸腺 苷（Rp - 8 - AHA - cAMPS)、琼脂糖凝胶固定的8 - (6 -己二胺基）-3'，5' -环硫代磷酸腺苷 (Rp - 8 - AHA - cAMPS - Agarose)、8 - (2 -乙二胺基）-3'，5' -环硫代磷酸腺苷（Rp-8-AEA- cAMPS)、8 - (2 -乙二胺基）-2' -氧代-甲基-3'，5' -环磷酸腺苷（8-AET-2'-0-Me- cAMP)、8 - (6 -己二胺基）-2' -氧代-甲基-3'，5' -环磷酸腺苷（8 - AHA - 2' - 0 - Me - cAMP)、8 -苄硫基-2' -氧代-甲基-3'，5' -环硫代磷酸腺苷（Sp - 8 - ΒηΤ - 2' - 0 - Me - cAMPS/〃S - 223〃）、8 -苄硫基-3 '，5 ' -环硫代磷酸腺苷（Sp - 8 - ΒηΤ - cAMPS/〃S - 220〃）、1 - N -氧基-3'，5' -环磷酸腺苷（1 - NO - cAMP)、3'，5' -环磷酸腺苷（cAMP)、N - 6 - (2 -氨乙 基）-3'，5' -环硫代磷酸腺苷（Sp -6 -AE -cAMPS)、8 - (2 - [DY -547]-氨乙硫基）-3'，5' - 环磷酸腺苷、8 - (6 -己二胺基）-2 -氯- 3'，5'-环磷酸腺苷（8 - AHA - 2 - Cl - cAMP)和 8 - (6 -己二胺基）-3'，5' -环磷酸腺苷（8 - AHA - cAMP)中的一种或多种的组合。所述 腺苷酸环化酶激动剂选自佛司可林。所述磷酸二酯酶抑制剂选自3 -异丁基-1 -甲基黄嘌 呤（IBMX)、西洛司特（Cilomilast)、罗氣司特（Roflumilast)、毛地黄黄酮（Luteolin)、二 轻丙茶碱（Dyphylline)、略利普兰（Rolipram)、枸橡酸西地那非（Sildenafil Citrate)、 他达拉非（Tadalafil)、伐地那非三水合盐酸盐（Vardenafil HC1 Trihydrate)、匹莫苯丹 (Pimobendan)、GSK256066、PF - 2545920、阿普斯特（Apremilast(CC - 10004))、西洛他唑 (Cilostazol)、甲氰吡酮（Milrinone)、阿伐那非（Avanafil)、氨茶碱（Aminophylline)、双 啼达莫（Dipyridamole)、多索茶喊（Doxofylline)和Deltarasin中的一种或多种。
[0007] 在一个实施方式中，所述溶瘤病毒选自Ml病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒、仙台病 毒、柯萨奇病毒、单纯性疱疹病毒、细小病毒、腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫 病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、流感病毒以及它们的 工程改造株。。在本发明的一些实施方式中，所述溶瘤病毒为Ml病毒或其工程改造株。
[0008] 在一个实施方式中，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。在一个实施方式中，所述肿瘤选 自肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、 肺癌、胃癌、卵巢癌和白血病。在一些实施方式中，所述肿瘤为对溶瘤病毒不敏感的肿瘤。在 一个实施方式中，所述肿瘤为对Ml溶瘤病毒不敏感的肿瘤。
[0009] 本发明另一方面提供一种生产溶瘤病毒的方法，包括：培养细胞；在培养的细胞 中接种溶瘤病毒；向培养的细胞中加入Epac直接或间接激动剂；收集细胞培养液，分离纯 化得到所述溶瘤病毒。在一个实施方式中，所述溶瘤病毒选自Ml病毒、盖塔病毒、辛德毕斯 病毒、仙台病毒、柯萨奇病毒、单纯性疱疹病毒、细小病毒、腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰质炎 病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、流感病毒 以及它们的工程改造株。在一个实施方式中，所述溶瘤病毒为Ml病毒或其工程改造株。
[0010] 本发明另一方面提供一种促进溶瘤病毒在肿瘤细胞中复制的方法，包括：在向所 述肿瘤细胞施用所述溶瘤病毒之前、之后或同时，向所述肿瘤细胞施用治疗有效量的Epac 直接或间接激动剂。
[0011] 本发明再一方面提供一种利用溶瘤病毒治疗患有肿瘤的对象的方法，包括：向所 述对象施用治疗有效量的所述溶瘤病毒；在步骤（a)进行之前、之后或同时，向所述对象施 用治疗有效量的Epac直接或间接激动剂。
[0012] 本发明证实，Epac直接或间接激动剂可用于辅助溶瘤病毒治疗肿瘤。细胞学实验 证明Epac激动剂引起多种肿瘤细胞的溶瘤病毒复制增加；动物实验证明Epac激动剂特异 地增加溶瘤病毒在肿瘤内的复制，从而抑制肿瘤的生长。
[0013] 本发明证实Epac激动剂具有选择性增加溶瘤病毒复制作用，安全性良好。Epac激 动剂能选择性增加肿瘤细胞病毒复制，而对正常细胞内病毒复制无影响，表明Epac激动剂 具有肿瘤细胞选择性；在荷瘤裸鼠体内，经尾静脉注射的Epac激动剂能选择性地增加肿瘤 组织溶瘤病毒量，而在正常组织内病毒量较低，二者病毒量相差约1〇2~1〇6倍，进一步阐明 了 Epac激动剂的肿瘤选择性。同时给予Epac激动剂和溶瘤病毒（例如Ml病毒）并不影 响裸鼠体重和精神状态，表明两者联合用药安全性良好。
【附图说明】
[0014] 图1 cAMP通路激活显著增加溶瘤病毒蛋白表达；
[0015] a) cAMP通路激活在肿瘤细胞中显著增加溶瘤病毒Ml结构蛋白和非结构蛋白的 表达；
[0016] b)cAMP通路激活在正常细胞中不增加溶瘤病毒Ml结构蛋白和非结构蛋白的表 达。
[0017] 图2 cAMP通路激活显著增加溶瘤病毒滴度；
[0018] a) cAMP通路激活在肿瘤细胞增加溶瘤病毒Ml的复制；
[0019] b) cAMP通路激活在正常细胞中不增加溶瘤病毒Ml的复制。
[0020] 图3 cAMP通路激活显著抑制抗病毒因子的表达；
[0021] a-f)Ml感染诱导抗病毒因子的表达；
[0022] g_i)Epac激动剂抑制Ml诱导的抗病毒因子的表达； j-1)Epac激动剂抑制Ml诱导的抗病毒因子的表达。
[0023] 图4 cAMP通路激活显著增加溶瘤病毒Ml引起的细胞病变效应；
[0024] a) cAMP通路激活在肿瘤细胞增加溶瘤病毒Ml引起的细胞病变效应；
[0025] b) cAMP通路激活在正常细胞中不增加溶瘤病毒Ml引起的细胞病变效应。
[0026] 图5 cAMP通路激活显著增加溶瘤病毒的抗肿瘤效应；
[0027] a) cAMP通路激活在肿瘤细胞增加溶瘤病毒的溶瘤效应；
[0028] b) cAMP通路激活在正常细胞中不增加溶瘤病毒的溶瘤效应。
[0029] 图6其它Epac激动剂显著增加溶瘤病毒的抗肿瘤效应；
[0030] a)Forskolin和8-CPT-cAMP也可以联合Ml显著抑制肿瘤细胞的生长；
[0031] b)Forskolin和8-CPT-cAMP也可以增加肿瘤细胞的滴度。
[0032] 图7 cAMP通路激活增加的溶瘤效应是通过Epac，而不是PKA ;
[0033] a) PKA干扰不能取消cAMP通路激活增加的溶瘤效应；
[0034] b) Epac 1干扰可以取消cAMP通路激活增加的溶瘤效应；
[0035] c) Epac 1，而不是PKA，介导的病毒蛋白的增加。
[0036] 图8 cAMP通路激活增加溶瘤病毒在体内的复制；
[0037] cAMP通路激活在肿瘤组织特异性增加溶瘤病毒的复制。QRT-PCR检测静脉注射 cAMP通路激活剂/Ml病毒后，其在HCT116荷瘤鼠的组织分布。**，p〈0. 01。
[0038] 图9 Epac激动剂与溶瘤病毒联用有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长；
[0039] a)Epac激动剂与Ml病毒静脉注射后对HCT116荷瘤鼠肿瘤体积的影响，Ml表示 Ml病毒处理组，对照组表示0ptiPR0?SFM培养基溶剂组，cAMP表示8-CPT-cAMP处理组。 cAMP+Ml表示8-CPT-cAMP和Ml病毒联合处理组；
[0040] b) Epac激动剂与Ml病毒静脉注射后对Η印3B荷瘤鼠肿瘤体积的影响，
[0041] c) Epac激动剂与Ml病毒静脉注射后对Capan-Ι荷瘤鼠肿瘤体积的影响，
[0042] 肿瘤体积以平均值土标准差表示，以重复测量的方差分析统计分析；**表示统计 学检验p〈0.01;i.v.表示尾静脉注射。
[0043] 图10 Epac激活在工具细胞中显著增加溶瘤病毒滴度；
[0044] Db-cAMP显著增加溶瘤病毒Ml在不同工具细胞中的复制。
【具体实施方式】
[0045] 如本文所用，术语"组合物"指适于给预期动物对象施用以达到治疗目的的制剂， 其含有至少一种药物活性组分，例如化合物。任选地，所述组合物还含有至