048]4.检测心脏瓣膜脱细胞基质对体外培养细胞的影响:
[0049]取步骤2分离得到的骨髓C-kit+干细胞，以密度3X 105个/cm2种植到0.5X0.5cm大小的步骤1所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜(弹力蛋白与胶原蛋白质量比为3: 7)上，置于培养板中进行培养。取等量的骨髓C-kit+干细胞直接置于培养板中进行培养，培养基以及培养条件与步骤3相同。在培养第5天，取培养的骨髓C-kit+干细胞(有和没有脱细胞基质)，多聚甲醛固定15分钟，0.5% Triton透膜15分钟，PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次。5%驴血清(Jakson，109558，美国)室温封闭1小时；加入100 μ 1的用1% BSA稀释的免疫荧光染色增殖标志ki67(BD，556003，美国，稀释比1: 200)以及ph3(cell signaling，9701S，美国，稀释比1: 300)的混合液；4°C冰箱孵育过夜；孵育后用PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次；加入100 μ 1的PBS稀释二抗donkeyant1-mouseAlexa555 (Invitrogen，1117032，USA)和 ldonkeyant1-rabbitAlexa488(Invitrogen，1531671,USA)的混合液，稀释比例均为1: 500 ;室温孵育1小时。孵育后用PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次；DAPI染色30秒，PBS洗涤两次，5分钟/次。荧光显微镜观察。结果如图5A所示，与单纯细胞培养相比细胞在电纺膜上增殖活跃。
[0050]同样的，取步骤2分离得到的骨髓C_kit+干细胞，以密度3 X105个/cm 2种植到含天然蛋白的电纺膜上，置于培养板中进行培养。取等量的骨髓C-kit+干细胞直接置于培养板中进行培养，培养基以及培养条件与步骤3相同。在第0、1、3、5、7、10、15天按20 μ 1/100 μ 1培养基分别加入MTT(promega，G5421，美国)，在5% C02的37°C培养箱孵育4小时，监测吸光光度值。如图5B、C所示，MTT增殖曲线结果示高蛋白含量组分可促进细胞增殖。
[0051]5.心肌补片对心功能的修复状况:
[0052]取6周龄的C57BL/6小鼠，异氟烷吸入麻醉，将麻醉好的小鼠固定于鼠板上，备皮，剪开胸部皮肤，在切口处荷包缝合，留线做备用。分离钳分离肌肉，小弯钳沿第4肋间穿刺入胸腔，牵开上下缘肋骨，挤出心脏，7-Oprolene线结扎左冠状动脉前降支制作心梗模型。
[0053]将步骤3制得的心脏补片(80NP 20PCL+cells和pure PCL+cells)、步骤1中制得的80% NP/PCL电纺膜(80NP 20PCL，弹力蛋白与胶原蛋白质量比为3: 7)和未种植骨髓C-kit+干细胞的单纯PCL电纺膜(Pure PCL)分别移植到心梗区域，(如图6A:为移植前各组分电纺膜照片；B:心脏补片已移植到心脏上)将心脏还纳，排气，关闭胸腔，将预留备用线打结。移植1周，4周后，行小动物心脏超声监测小鼠心功能状况。将正常小鼠作为对照组(control)，同时对心梗未治疗小鼠(MI)行小动物心脏超声。
[0054]如图7A所示:移植7天和28天的心脏超声典型图片；7B:纯心梗组，其心功能差，心梗7天后射血分数(EF)值为25.9 ±2.5，移植种植骨髓C_kit+干细胞心脏补片组7天后EF 值分别为 45.4±2.5(80NP 20PCL+cells 组)和 43.0±2.4 (pure PCL+cells 组)，移植未种植骨髓C-kit+干细胞心脏补片组7天后EF值分别为35.1 ±3.4 (80NP 20PCL组)和32.2±1.6(pure PCL 组)。7C:pure MI 组，心梗 7 天后心室缩短率(FS)值为 12.7± 1.5，移植种植骨髓C-kit+干细胞心脏补片组7天后EF值分别为23.8±2 (80NP 20PCL+cells组)和21.8±1.l(pure PCL+cells组)，移植未种植骨髓C_kit+干细胞心脏补片组7天后EF 值分别为 17.4± 1.8 (80NP 20PCL 组)和 16.1 ±0.9 (pure PCL 组)。
[0055]图7D:纯心梗未移植心脏补片组，其心梗28天后EF值为38.9 ±3.7，移植种植骨髓C-kit+干细胞心脏补片组28天后EF值分别为55.8±2.8(80NP 20PCL+cells组)和47.2±1.6(纯PCL+cells组)，移植未种植骨髓C_kit+干细胞心脏补片组EF值分别为46.3 ±4.6 (80NP 20PCL 组)和 45.7 ±5.1 (pure PCL 组)。7E:pure MI 组，心梗 28 天后心室缩短率(FS)值为18.6±1.9，移植种植骨髓C-kit+干细胞心脏补片组28天后心室缩短率(FS)值分别为 28.2±2(80NP 20PCL+cells 组)和 23.8±1.0(pure PCL+cells 组)，移植未种植骨髓C-kit+干细胞心脏补片组7天后EF值分别为22.7± 1.8 (80NP 20PCL组)和 22.2 ±2.1 (pure PCL 组)。
[0056]移植后28天所有小鼠均脱颈处死。处死小鼠时，可见心脏表面附有完整的心脏补片，补片上可见较丰富的血管丛新生。(图6C:移植心梗后28天，心脏表面可见完整心脏补片。其表面可见新生血管形成)PBS冲洗后，进行TTC染色，白色部分为心梗部位，如图8所示。心脏补片治疗组(包括种植细胞和未种植细胞组)心梗面积小于纯MI组。在心脏补片治疗组中，80NP 20PCL+cells组，心梗面积最小。
【主权项】
1.一种天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜，通过将天然蛋白和聚己内酯混合配制纺丝液，经电纺而成，所述的天然蛋白包含天然弹力蛋白和天然胶原蛋白。2.权利要求1所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜的制备方法，其特征在于，包括:将天然弹力蛋白和天然胶原蛋白按照质量比1: 9?3: 7混合成天然蛋白混合物，将所述的天然蛋白混合物与聚己内酯按照质量比2: 8?8: 2混合，溶于六氟异丙醇或三氟乙醇中，搅拌，得到纺丝液，电纺，所述的电纺条件为:电压为12-18kV，接收距离为10-20cm，注射速率为1.2ml/h，环境温度为室温，相对湿度为20-80%，得到天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜。3.如权利要求2所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜的制备方法，其特征在于，所述的聚己内酯/天然蛋白混合物与六氟异丙醇或三氟乙醇的质量体积比为15%。4.权利要求1所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用。5.如权利要求4所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用，其特征在于，所述的组织工程移植物为用于修复缺血性心肌损伤、改善心脏功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重构的组织工程移植物。6.如权利要求4所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用，其特征在于，所述的组织工程移植物为用于修复除心脏缺损外的其他组织缺损疾病的组织工程移植物。7.权利要求1所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜作为细胞体外培养介质中的应用。8.—种心脏补片，其特征在于，包含种子细胞以及权利要求1所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜。9.如权利要求8所述的心脏补片，其特征在于，所述的种子细胞为骨髓来源的c-kit+干细胞、骨髓单个核细胞、间充质干细胞、心肌去分化细胞、心肌干细胞及胚胎干细胞来源的细胞中的至少一种。10.权利要求8所述的心脏补片的制备方法，其特征在于，包括:将种子细胞种于上述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜上，培养得到心肌补片。
【专利摘要】本发明提供了一种天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜及其制备和应用。所述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜，通过将天然蛋白和聚己内酯混合配制纺丝液，经电纺而成，所述的天然蛋白包含天然弹力蛋白和天然胶原蛋白。本发明将含有心肌组织细胞外基质成分的天然蛋白和人工合成的可降材料混合，通过静电纺丝技术快速，有效的制成纳米纤维膜，具有操作简单，材料易获得，制作成本低廉的优势。本发明不仅保留良好的生物力学性能，而且充分模拟心肌细胞外基质环境。从结构和成分两方面进行仿生模拟，改善干细胞移植治疗心肌梗死的治疗效果。因此可以作为细胞外培养介质提供促进细胞粘附，存活，增殖的细胞外基质微环境。
【IPC分类】A61L27/26, A61L27/18, D04H1/728, A61L27/44, D01D1/02
【公开号】CN105233345
【申请号】CN201510527206
【发明人】陈瑶, 薛松, 刘洋, 谢静
【申请人】上海交通大学医学院附属仁济医院
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年8月25日