用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法、所获得的悬浮液的制作方法
【专利说明】用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法、所获 得的悬浮液
[0001] 本发明涉及用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法。本发明还涉及用 于制备这样的悬浮液的方法、使用这些悬浮液的处理方法以及包封有活性成分之红细胞的 新型稳定悬浮液。
[0002] 已描述了多种允许将活性成分掺入到红细胞中的方法。在这些方法中，所谓的裂 解-重密封技术（lysis-resealing technique)是最普遍的。该技术包括三种变化形式，它 们是低渗透析、低渗预膨胀和低渗稀释，所有均基于红细胞内部和外部之间的渗透压差异。 这些变化形式的共同之处是以下五个步骤：清洗红细胞残留物并将其在生理缓冲液中离心 一次或更多次，使红细胞与低渗液体介质接触导致红细胞膜中的孔打开，活性成分进入红 细胞，使用高渗缓冲液使孔关闭（重密封）从而将活性成分封闭在红细胞内，然后将红细胞 悬浮置于保存液中。低渗透析法是最有利的并且是工业发展的主题。EP 1 773 452中所述 的方法是目前提供了最佳表现的方法，并且具有以下优点：其是可重复的并且提高活性成 分的包封产率。
[0003] 由此获得的产品的稳定性是其在人治疗中使用的关键要素。特别地，当将产品注 射到患者中时，产品中包含的细胞外血红蛋白的量必须低于预定阈值。例如，美国食品药品 管理局（Food and Drug Administration，FDA)所要求的细胞外血红蛋白的阈值为在用于 人注射之终产品中0. 2g/dL或更低。
[0004] 用现有技术方法获得的产品在其储存期间经历溶血并且在注射之前经历运输。由 于大部分脆性红细胞破裂，此溶血使血红蛋白释放到细胞外介质中，结果是在注射这些产 品时，其已不再满足FDA的要求。
[0005] 因此，本发明的一个目的是提出一种方法，使用该方法可提高包封有活性成分的 红细胞悬浮液的稳定性。
[0006] 特别地，本发明的一个目的是提出允许产生红细胞的悬浮液的方法，所述悬浮液 掺入活性成分并且在储存后具有稳定的细胞外血红蛋白水平或者与FDA或任何其他健康 权威机构提供的推荐保持一致。
[0007] 本发明的另一个目的是提出适用于包封有活性成分之红细胞的任何悬浮液的所 述方法，无论其制备方法，特别是使用裂解-重密封法。
[0008] 本发明的另一个目的是提出允许产生包封有活性成分之红细胞的悬浮液的所述 方法，所述悬浮液是经稳定化的并且具有高细胞产率。
[0009] 可如下实现这些及其他目的：除去由包封过程（即重密封后）产生的悬浮液中的 大部分脆性红细胞以获得包含最大可能比例之抗溶血性红细胞的悬浮液。因此，可将红细 胞的悬浮液保存直至将其注射到患者中，其中悬浮液不会经历显著溶血，使其可在注射时 获得具有低细胞外血红蛋白水平的悬浮液。因此，本发明的方法提供了大部分脆性红细胞、 细胞外血红蛋白和细胞外活性成分的去除。本申请人已成功实现这一点，同时维持良好的 细胞产率，在去除大部分脆性红细胞和保留最大数量红细胞之间找到良好折衷。本申请人 甚至已能够确定出人意料地使包封有活性成分之红细胞的悬浮液稳定同时提高细胞产率 的条件。
[0010] "包封"意指活性成分基本上或者完全包含在内部。"基本上"意指小比例的活性 成分可另外被捕获在膜中。
[0011] "包封有活性成分"意指红细胞掺入具有活性成分功能的分子或者意指由红细胞 及其掺入的分子形成的组装物具有活性成分功能。
[0012] "孵育溶液"意指在进行孵育步骤期间其中含有包封有活性成分的红细胞的溶液。 孵育可在宽血细胞比容范围内，特别是10%至85%血细胞比容内进行。
[0013] "保存液"意指将包封有活性成分的稳定化红细胞以其适合储存的形式悬浮置于 其中直至使用的溶液。保存液优选包含至少一种促进红细胞保存的试剂，其特别是选自葡 萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇。
[0014] "脆性红细胞"意指通过掺入操作获得的这样的红细胞，当将悬浮液储存在2°C至 8°C时，其一旦在保存液中呈悬浮状态就可能裂解，特别是在1小时至72小时后。
[0015] "初始血细胞比容"意指在孵育期间，在由于脆性红细胞裂解而引起细胞损失之前 的血细胞比容。
[0016] 概念"稳定化"基本上通过掺入活性成分之红细胞随时间的稳定性，特别是根据细 胞内血红蛋白的损失或细胞外血红蛋白水平来评估。
[0017] "红细胞的稳定化悬浮液"特别地意指这样的悬浮液，在其于人中使用之前，其细 胞外血红蛋白水平维持在0. 5g/dL或更低，特别是0. 3g/dL或更低，优选0. 2g/dL或更低， 这样的使用可发生在产生该批掺入活性成分之红细胞后1小时至72小时。其特征还可在 于：在2°C至8°C的温度下储存72小时时，溶血率维持在2%或更低，特别是1. 5%或更低， 优选1 %或更低。
[0018] "红细胞的即用型稳定化悬浮液"意指在允许被注射到患者中的溶液中的稳定化 悬浮液，特别是在保存液中的稳定化悬浮液。其血细胞比容一般为40 %或更高。
[0019] "红细胞的残留物"或经包装红细胞意指在使红细胞与液体介质分离后收集的红 细胞浓缩物，其中红细胞此前以悬浮状态存在于所述液体介质中。分离可通过过滤或离心 来进行。离心是此类分离通常使用的方式。残留物包含一定比例的液体介质。一般来说， 残留物的血细胞比容为70 %至85%。
[0020] 不管用于掺入或包封活性成分的技术，均可应用所述方法。最特别地，其可应用于 前沿的裂解-重密封技术，特别是使用低渗透析的裂解-重密封技术，优选地本领域技术人 员可参考EP 1 773 452中所述的方法。EP 1 773452的内容通过引用并入本文。通过阅读 以下说明将理解，本发明的稳定化方法可应用于包封有活性成分之经重密封红细胞的悬浮 液或残留物，或者可包括在获得经重密封红细胞的悬浮液或残留物之前进行的裂解和重密 封步骤。
[0021] 因此，本发明的一个目的是用于由掺入活性成分的经重密封红细胞获得包封有活 性成分之红细胞（red blood cell，RBC)的稳定化悬浮液的方法。所述方法包括将经重密封 红细胞在孵育溶液中孵育，所述孵育溶液的渗量浓度（osmolality)为不低于280m0sm〇l/ kg，特别是约 280m0smol/kg 至约 380m0smol/kg，优选约 290m0smol/kg 至约 330m0smol/kg。 特别地，孵育进行30分钟或更长的时间，特别是1小时或更长的时间。将孵育称为后重密 封（post-resealing)，即其对经重密封的RBC进行。然后，从经孵育的悬浮液中除去液体介 质并将所获得的RBC悬浮置于允许悬浮液被注射到患者中的溶液中，优选地允许悬浮液被 注射到患者中的保存液中。
[0022] 孵育溶液通常是包含至少允许调节渗量浓度的离子的盐水溶液（例如，基于 NaCl、KC1和/或磷酸盐的溶液）。孵育溶液可包含其他成分，特别是碳水化合物，尤其是糖 类，和/或允许调节pH(特别是约6至约8. 5,优选约7至约7. 5)的酸性和/或碱性添加 剂。孵育溶液不包含任何使RBC膜变性的试剂，例如桥连或交联化学试剂，例如双（磺基琥 珀酰亚胺）辛二酸酯（BS3)、戊二醛和神经氨酸酶。因此，孵育溶液是惰性孵育溶液或不使 经重密封RBC的膜变得脆弱的溶液。
[0023] 在一个实施方案中，所述方法包括在孵育之前，通过裂解-重密封将活性成分包 封到RBC中并获得包含活性成分的经重密封RBC。
[0024] 优选地，在孵育之前对经重密封的RBC进行清洗（至少1个清洗循环）。
[0025] 应用所述方法的经重密封RBC可以是RBC在保存液中的悬浮液。然后，可用孵育 溶液稀释保存液以得到数值符合本发明的渗量浓度。或者，可例如通过离心或过滤使RBC 与保存液分离，然后添加孵育溶液。还可对经重密封的RBC进行清洗（至少1个循环，如下 文所述）；清洗循环优选包括在悬浮置于孵育溶液中之前，将悬浮液稀释，然后分离。应用 所述方法的经重密封RBC还可以是仍然在重密封溶液中的经重密封RBC的悬浮液。然后， 可例如通过离心或过滤使RBC与重密封溶液分离，和/或对经重密封RBC进行清洗（至少 1个循环，如下文所述）；清洗循环优选包括在悬浮置于孵育溶液中之前，将悬浮液稀释，然 后分离。
[0026] 因此，所述方法包括将经重密封RBC置于孵育溶液中并进行孵育，所述孵育溶液 的渗量浓度为不低于280m0smol/kg，特别是约280m0smol/kg至约380m0smol/kg，优选约 290m0smol/kg 至约 330m0smol/kg。
[0027] 特别地，本发明的主题是用于获得包封有活性成分之红细胞（RBC)的稳定化悬浮 液的方法，其包括通过裂解-重密封将活性成分包封在RBC内，获得包含掺入活性成分之经 重密封RBC的悬浮液或残留物，对经重密封的RBC进行清洗（至少1个清洗循环），然后将 其置于孵育溶液中并进行孵育，所述孵育溶液的渗量浓度为不低于280m0sm〇l/kg，特别是 约 280m0smol/kg 至约 380m0smol/kg，优选约 290m0smol/kg 至约 330m0smol/kg。特别地， 孵育进行30分钟或更长的时间，特别是1小时或更长的时间。然后，除去经孵育悬浮液中 的液体介质并将获得的RBC悬浮置于允许悬浮液被注射到患者中的溶液中，优选允许悬浮 液被注射到患者中的保存液中。所指定的渗量浓度为溶液的渗量浓度，其中在所考虑时间 时RBC以悬浮液或残留物形式存在于所述溶液中。
[0028] 符合本发明的方法具体包括以下步骤：
[0029] (a)将活性成分包封在RBC内，其包括与低渗介质（使RBC膜中的孔打开）接触， 与活性成分（使进入RBC中）接触，特别是使用等渗或高渗介质（优选高渗介质）使RBC 重密封；
[0030] (b)获得或制备包含掺入活性成分之RBC的悬浮液或残留物和渗量浓度不低于 280m0smol/kg、特别是约 280m0smol/kg 至约 380m0smol/kg、优选约 290m0smol/kg 至约 330m0smol/kg 的溶液；
[0031] (c)将步骤（b)中的残留物或悬浮液原样或者在添加孵育溶液之后孵育30分钟或 更长、特别是1小时或更长的时间，所述悬浮溶液的渗量浓度为不低于280m0sm〇l/kg，特别 是约 280m0smol/kg 至约 380m0smol/kg，优选约 290m0smol/kg