用于治疗白血病的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于治疗白血病的方法和组合物 发明背景
[0001] 白血病是一类血液或骨髓的癌症，其特征为被称为"母细胞（blast)"的不成熟白 细胞的异常增加。白血病是涵盖一系列疾病的广义术语。反过来说，它是影响血液、骨髓和 淋巴系统的更广泛的一组疾病的一部分，该组疾病均被称为血液肿瘤。
[0002] 在临床和病理学上，白血病被细分成多个大组。第一种划分在其急性与慢性形式 之间。急性白血病是与白血病的最初诊断相关的一类严重的医学病状。急性白血病的形式 包括：急性髓样白血病、急性红白血病（acute erythroid leukemia)、急性淋巴母细胞白血 病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、前体T急性淋巴母细胞白 血病/淋巴瘤、慢性髓性白血病的原始细胞危象。慢性白血病是异常白细胞的增加。它与 急性白血病不同，并被分类为髓性的或淋巴细胞性的。慢性白血病可指：慢性髓性白血病、 慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病。另外，根据哪种血细胞受到影响而对疾病进行细分。 这种分类法将白血病分为淋巴母细胞或淋巴细胞白血病以及髓样或髓性白血病。
【发明内容】
[0003] 在一方面，本文提供了用于治疗受试者的白血病或降低受试者患白血病的风险的 方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的环己烯酮化合物或其药学上可接受的 盐、代谢物、溶剂化物或前药，该环己烯酮化合物具有结构：
其中X和Y中的每一个独立地为氧、NR5或硫； R为氢或C( = 0)(；-(；烷基； 1^、1?2和1?3中的每一个独立地为氢、任选取代的甲基或 R4SNR5R6、0R5、0C( = 0)R7、C( = 0)0R5、C( = 0)R5、C( = 0)NR5R6、卤素、5 元或 6 元内 酯、C「CS烷基、C 2-Cs烯基、C 2-Cs炔基、芳基、葡糖基，其中该5元或6元内酯、C「Cs烷基、C 2-Cs烯基、c2-cs炔基、芳基和葡糖基任选地被选自NR5R 6、0R5、0C( = 0)R7、C( = 0)0R5、C( = 0) R5、C( = 0)NR5R6、Ci-Q烷基、c 2-cs烯基、c 2-cs炔基、C 3-(：8环烷基和c ^通代烷基的一个 或多个取代基所取代； 尺5和R 6中的每一个独立地为氢或c 烷基； R7为 CfCs烷基、or5或 nr5r6; m = 1-12 ;且 η = 1-12〇 援引并入
[0004] 本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度 等同于特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
【附图说明】
[0005] 本发明的新特征在所附的权利要求中具体阐明。通过参考以下对在其中利用到本 发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点 的更好的理解，在附图中：
[0006] 图1显示了化合物1刺激IfepG2、A549和H838细胞系中的ERK磷酸化的示例性结 果。使Η印G2、A549和H838细胞系血清饥饿过夜并用指定浓度的化合物1攻击lh。然后 将全细胞裂解物用磷酸-ERK1/2抗体进行免疫印迹，并用抗β -肌动蛋白的抗体进行再探 测。用总ERK1/2抗体探测复制的膜。通过密度测定法量化p-ERKl/2相对于β-肌动蛋白 的相对表达水平。一式三份进行实验。
[0007] 图2A-C显示了示例性化合物1抑制癌细胞系中的Ras加工的说明性有效结果。 (2A) A549和H838细胞用不同浓度的化合物1处理并在血清（10% FBS)或无血清（无 FBS) 条件下生长24h。（2B)H838、（2C)!fepG2和K562细胞用不同浓度的化合物1处理并在无血 清（无 FBS)条件下生长24h。然后将全细胞裂解物用Ras抗体进行免疫印迹。用GAPDH抗 体探测复制的膜。通过密度测定法量化未加工的Ras相对于加工的Ras的相对表达水平。 该实验进行三次。线条表示平均值土 SEM。*P〈0. 05，**P〈0. 01。
[0008] 图3A-C显示了化合物1在体外抑制法尼基转移酶的异戊二烯化活性以及在细胞 内与FPP竞争的说明性有效结果。（3A)化合物1和FPP的化学结构。（3B)用化合物1或 FPP如所指示的刺激24h的H838细胞。然后将全细胞裂解物用Ras抗体进行免疫印迹。用 GAPDH抗体探测复制的膜。通过密度测定法量化未加工的Ras相对于加工的Ras的相对表 达水平。该实验进行三次。（3C)在由法尼基转移酶（FTase)介导的、用NBD-FPP进行的异 戊二烯化后，荧光标记的H-Ras-GST的SDS-PAGE。下方的图显示了用考马斯蓝（Coomassie blue)染色的相同凝胶。
[0009] 图4A-D显示了与化合物1、CIFM-衍生的L739、750肽模拟物和FPP底物复合的 人法尼基转移酶的模型结构。（4A)与化合物1复合的法尼基转移酶的丝带卡通图（Ribbon cartoon)。（4B)化合物1 (绿色）和FPP (紫色）与法尼基转移酶的同时结合。（4C)与安卓 奎诺尔（Antroquinonol)复合的法尼基转移酶的丝带卡通图。（4D)与化合物1和CIFM-衍 生的L739、750复合的法尼基转移酶的丝带卡通图。
[0010] 图5A-C显示了化合物1诱导H838细胞中的自体吞噬活性的说明性有效结果。 H838细胞用不同浓度的化合物1处理并在无血清条件下生长。（5A)在处理后0、24和48h 时收获细胞，并用Beclin-1抗体进行免疫印迹。（5B)在处理后24h时制备全细胞裂解物， 并用LC3B抗体进行免疫印迹。用GAPDH抗体探测复制的膜。通过密度测定法量化LC3B-I 相对于LC3B-II的相对表达水平。（5C)通过共聚焦显微术检测自噬体中的内源性LC3B的 分布。该实验进行三次。线条表示平均值土 SEM。*P〈0. 05，**P〈0. 01。
[0011] 图6显示了化合物1的细胞毒活性与癌细胞系中Ras和EGFR的蛋白质水平之间 的说明性相关性。全细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析并用Ras抗体进行免疫印迹。用 抗EGFR或GAPDH的抗体探测复制的膜。该实验进行三次。
[0012] 图7显示了示例性的示意图，其说明了所提出的化合物1的作用机制。具有末端 箭头的线表示活化和上调，而在末端具有垂线的线表示抑制和下调。灰色虚线圆表示尚未 验证的分子。短划线边缘表示尚未验证的相互作用。"P"表示磷酸化。
【具体实施方式】
[0013] Ras蛋白是小的GTP酶，其似乎参与多个信号途径，从而导致复杂且相异的效应。 Ras蛋白的活化通过翻译后修饰来调节，该翻译后修饰包括法尼基转移酶介导的Ras的异 戊二烯化。异戊二烯化对于蛋白质的Ras超家族的正常功能和转化活性是必要的。因此， 已经开发了阻断Ras异戊二烯化的药剂以干扰癌细胞存活和增殖。本文所述的示例性化 合物1是从牛樟芝（Antrodia camphorata)中分离的新型法尼基化的醌类衍生物。对接 (docking)研究表明，化合物1的法尼基类异戊二烯尾部插入到与FPP的法尼基相似的法尼 基转移酶β -亚基的中央腔中（参见图5)。法尼基转移酶抑制试验揭示，化合物1在体外 以剂量依赖性方式抑制法尼基转移酶（参见实施例10)。此外，在化合物1施用后，未加工 的Ras与已加工的Ras的比值增加（参见图2)。所有这些数据均支持以下结论：示例性化 合物1及其类似物与法尼基转移酶相互作用以阻止癌细胞内部的Ras加工。
[0014] 已经证实化合物1在本文所述的癌细胞系中的IC5。值与Ras和表皮生长因子受体 (EGFR)的表达相关。本文所述的数据提示，Ras和EGFR的蛋白质水平，而不是Ras和EGFR 基因中突变的存在，是癌细胞中安卓奎诺尔诱导的细胞毒性的主要决定因素。
[0015] 使用分子建模和基于对接的方法来证明GGT酶-I与化合物1之间相互作用的可 能性。先前的研究揭示，化合物1通过几种信号分子（包括AMPK、PI3K和mTOR)来触发抗 肿瘤活性（参见，例如，Kumar VB 等人，Mutat Res 2011年 2 月 10 日；707(1-2) :42-5229 ; Yu C-C 等人，The Journal of nutritional biochemistry 23(8) :900-907 ;Chiang P-C 等人，Biochemical Pharmacology 79 (2) : 162-171)。在此，在一些实施方案中提供了通过 抑制法尼基转移酶活性来抑制Ras加工的示例性环己烯酮化合物（例如，化合物1)。有助 于化合物1介导的抗肿瘤活性的可能的信号途径汇总于图7中。与增殖、运动性、代谢和分 化相关的Ras-PI3K-Akt-mT0R途径响应于化合物1而得到抑制。其他关键的信号分子，诸 如ERK1/2和AMPK，响应于化合物1处理而被诱导。若干研究已经发现，ERK1/2和AMPK参 与凋亡性细胞死亡和自体吞噬性细胞死亡的不同方面。据推测，多个信号途径响应于化合 物1刺激而同时被活化。因此，在一些实施方案中，本文提供的环己烯酮化合物（例如，化 合物1)通过调节导致凋亡和自体吞噬的复杂信号网络中的串扰来促进抗癌效果。
[0016] 对异戊烯转移酶活性的抑制阻抑了多种信号分子的异戊二烯化，从而干扰下游信 号传导。Ras是复杂网络中调节正常细胞生长和恶性转化的若干方面的关键信号传导蛋白。 在Ras中，尤其是K-Ras中激活突变，经常发生在人类癌症中。因此，靶向Ras是用于治疗 癌症的有前景的策略。基于生化表征和分子对接分析，本文提供的环己烯酮化合物（例如， 化合物1)通过抑制法尼基转移酶来抑制Ras加工，最终导致细胞死亡。
[0017] 白血病是骨髓和血液的恶性癌症。其特征为血细胞的不受控生长。急性白血病是 进展迅速的疾病，它导致骨髓和血液中不成熟、无功能的细胞的大量积累。骨髓通常不再能 产生足够的正常红细胞和白细胞以及血小板。贫血（红细胞的缺乏）在几乎所有的白血病 患者中出现。正常白细胞的缺乏损害了身体对抗感染的能力。血小板的短缺导致瘀伤并容 易出血。在另一方面，慢性白血病进展较缓慢并导致不受调节的增殖，并因此导致一系列成 熟的（分化的）细胞的明显过度扩张。
[0018] 在一些实施方案中，本文提供了通过向受试者（例如，人）施用本文所述的环己烯 酮化合物来治疗患有白血病的受试者或降低受试者患白血病的风险的方法。该环己烯酮 化合物为正在接受白血病治疗的受试者提供了治疗益处（参见实施例1-13)。在一些实施 方案中，该环己烯酮化合物从天然产物的提取物中获得并提供了减少的并发症和/或副作 用。在一些实施方案中，本发明提供了示例性环己烯酮化合物（例如，化合物1)用于治疗 白血病或降低白血病风险的治疗和预防潜力。
[0019] 在一些实施方案中，提供了用于治疗患有白血病的受试者或降低受试者患白血病 的风险的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的环己烯酮化合物或其药学上可接受
的盐、代谢物、溶剂化物或前药，该环己烯酮化合物具有结构 其中X和Y中的每一个独立地为氧、NR5或硫； R为氢或C( = 0)(；-(；烷基； 1^、1?2和1?3中的每一个独立地为氢、任选取代的甲基或 R4SNR5R6、0R5、0C( = 0)R7、C( = 0)0R5、C( = 0)R5、C( = 0)NR5R6、卤素、5 元或 6 元内 酯、C「CS烷基、C 2-Cs烯基、C 2-Cs炔基、芳基、葡糖基，其中该5元或6元内酯、C「Cs烷基、C 2-Cs烯基、c2-cs炔基、芳基和葡糖基任选地被选自NR5R 6、0R5、0C( = 0)R7、C( = 0)0R5、C( = 0) R5、C( = 0)NR5R6、Ci-Q烷基、c 2-cs烯基、c 2-cs炔基、C 3-(：8环烷基和c ^通代烷基的一个 或多个取代基所取代； 尺5和R 6中的每一个独立地为氢或c 烷基； R7为 CfCs烷基、or5或 nr5r6; m = 1-12 ;且 η = 1-12〇
[0020] 在一些实施方案中，所述白血病是急性白血病，如急性髓样白血病、急性红白血 病、急性淋巴母细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、前 体T急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤或慢性髓性白血病的原始细胞危象。在一些实施方案 中，所述白血病是慢性白血病，如慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病。在 某些实施方案中，所述慢性白血病是慢性髓性白血病。在一些实施方案中，所述受试者是 人。参见实施例2-13。
[0021] 在一些实施方案中，具有结构 的环己烯酮化合物由任 何合适的起始材料经合成或半合成方式制备。在其他实施方案中，该环己稀酮化合物通过 发酵等制备。例如，化合物1和3-7从有机溶剂提取物中分离。以下示出了非限制性的示 例性化合物。
[0022] 在其他实施方案中，具有结构
的环己烯酮化合物从牛 樟芝的有机溶剂提取物中分离得到。在一些实施方案中，该有机溶剂选自：醇类（例如，甲 醇、乙醇、丙醇等）、酯类（例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯等）、烷烃（例如，戊烷、己烷、庚烷等）、 卤代烷烃（例如，氯甲烷、氯乙烷、氯仿、二氯甲烷等），等等。例如，示例性化合物1-7从有 机溶剂提取物中分离得到。在某些实施方案中，该有机溶剂是醇。在某些实施方案中，该醇 是乙醇。在一些实施方案中，该环己烯酮化合物从牛樟芝的水性提取物中分离得到。
[0023] 在一些实施方案中，R为氢、C( = 0)C3Hs、C( = 0)C2H5或C( = 0)CH3。在一些实 施方案中，&为氢或甲基。在某些实施方案中，R2为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己 基。在一些实施方案中，R3为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。在一些实施方案中， R4为卤素、NH2、NHCH3、N(CH3) 2、0CH3、0C2H5、C( = 0)CH3、C( = 0)C2H5、C( = 0)0CH3、c(= 0)0C2H5、C( = 0)NHCH3、C( = 0)NHC2H5、C( = 0)NH2、0C( = 0)CH3、0C( = 0)C2H5、0C( = 0) 0CH3、0C( = 0)0C2H5、0C( = 0)NHCH3、0C( = 0)NHC2H5或 0C( = 0)NH2。在一些实施方案中， 尺4为 C 2H5C (CH3) 20H、C2H5C (CH3) 20CH3、CH2C00H、C2H5C00H、CH 20H、C2H50H、CH2Ph、C2H 5Ph、CH2CH = C (CH3) (CHO)、CH2CH = C (CH3) (C ( = 0) CH3)、5 元或 6 元内酯、c2-cs烯基、C 2-Cs炔基、芳基和 葡糖基，其中该5元或6元内酯、c2-cs烯基、C 2-Cs炔基、芳基和葡糖基任选地被选自NR 5R6、 or5、oc ( = o) r7、c ( = o) or5、c ( = o) r5、c ( = o) nr5r6、c「cs 烷基、c 2-cs 烯基、c 2-cs 炔基、 C3-Cs环烷基和C i-C；·代烷基的一个或多个取