白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞（Caco-2)的宿主因子，从而达 到在肠道系统阻断病毒感染人体的目的。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进 行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它 们往往也是在病毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。这些分子包括:ADP核糖 基化因子 6(ARF6)、caveolin-l(CAVl)、caveolin_2(CAV2)、caveolin_3(CAV3)、网格蛋白 轻链A(CLTA)、网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链（CLTC)、Flotillin蛋白I (FL0T1)、 Flotillin 蛋白 2 (FL0T2)、GTP 酶激活蛋白（GRAFl)、白细胞介素 2 受体（IL2RB)、VPS4A、 HRS、Rab5a、Rab5b、Rab5c。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的 网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列， 然后设计siRNA，通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。
[0015] 本发明发现肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物O^patocyte growthfactor-regulated tyrosine kinasesubstrate，HRS)在 EV71 感染 Caco-2 中均发 挥着重要的作用，下调HRS的表达，能明显抑制EV71的感染。
[0016] 本发明的第一方面，本发明提供了肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HRS) 在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。
[0017] 本发明提供了 HRS作为一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。
[0018] 进一步地，本发明还提供肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HRS)在制备预 防或治疗手足口病药物中的应用。
[0019] 本发明所述的肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HRS)在制备预防或治疗 肠道病毒71型感染药物中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调HRS的表达量的试剂。
[0020] 所述的抑制下调HRS的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的 重组载体（如质粒）等。
[0021] 本发明的第二方面，本发明提供了肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HRS) 的干扰RNA在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，所述的干扰RNA(SiRNA) 的序列如下：
[0022] 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物干扰RNA序列：
[0023] GGUAUCUCAACCGGAACUACU(SEQ ID N0:37)
[0024] CGGAGUAACACUACAUACAGU(SEQ ID NO :38)
[0025] CAGAAUGGUACAGCGAUAAUA(SEQ ID NO :39)
[0026] 其中，以如SEQ ID NO: 39下调HRS的表达量效果最佳，且降低EV71对Caco-2细 胞的感染最为明显；
[0027] 本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞的新的宿主细胞分子HRS。HRS基 因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了 EV71对Caco-2细胞的感染。
[0028] 因此，本发明为临床预防和治疗因 EV71感染所导致手足口病、神经系统和心肺系 统疾患提供了新的靶点和治疗方案。
【附图说明】
[0029] 图1为转染有效SiRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效 率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；
[0030] CTRL :不转染任何SiRNA的Caco-2细胞组（空细胞组）；
[0031] NT-CTRL :转染 non-targeting siRNA 的 Caco-2 细胞组（阴性对照组）；
[0032] siRNA :转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组（实验组）。
[0033] 图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，其中A为下调各分 子后对病毒感染性的荧光检测图，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；
[0034] CTRL :不转染任何siRNA的Caco-2细胞组（空细胞组）；
[0035] NT-CTRL :转染 non-targeting siRNA 的 Caco-2 细胞组（阴性对照组）；
[0036] siRNA :转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组（实验组）。
[0037] 图3为转染VPS4A、HRS分子的不同干扰序列后的干扰效率及对EV71感染性的影 响图，A为VPS4A基因的mRNA水平检测图，B为HRS基因的mRNA水平检测图，C为干扰VPS4A 基因后EV71病毒量检测图，D为干扰HRS基因后EV71病毒量检测图；
[0038] CTRL :不转染任何siRNA的Caco-2细胞组（空细胞组）；
[0039] NT-CTRL :转染 non-targeting siRNA 的 Caco-2 细胞组（阴性对照组）；
[0040] VPS4A-34 :转染针对 VPS4A 基因的 siRNA(SEQ ID N0:34)的 Caco-2 细胞组；
[0041] VPS4A-35 :转染针对 VPS4A 基因的 siRNA(SEQ ID N0:35)的 Caco-2 细胞组；
[0042] VPS4A-36 :转染针对 VPS4A 基因的 siRNA(SEQ ID N0:36)的 Caco-2 细胞组。
[0043] HRS-37 :转染针对 HRS 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 37)的 Caco-2 细胞组；
[0044] HRS-38 :转染针对 HRS 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 38)的 Caco-2 细胞组；
[0045] HRS-39 :转染针对 HRS 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 39)的 Caco-2 细胞组。
【具体实施方式】
[0046] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0047] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0048] 实施例1 :
[0049] 1、设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。
[0050] I. 1针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有 的网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序 列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对 比，确保无同源性；排除aitisense链的5'端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA ; 排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测 定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见 表1。
[0051] 1. 2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。
[0052] 表1 · s i RNA靶点的设计
[0056] 2、siRNA序列筛选与干扰效果鉴定
[0057] 2. IRNA 转染
[0058] 转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书
[0059] 1)提前12-16小时将Caco-2细胞（购自Sciencel 1，保藏号：1000)铺在24孔细 胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80 % -90 %。
[0060] 2)取 2 μ LLipofectamine 2000 加入 50 μ Lopti-MEM 中并轻柔混匀，室温孵育 5 分钟；另取5 μ L浓度为5 μΜ的干扰RNA和50 μ Lopti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的 Lipofectamine 2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室温孵育20min后，加 入Caco-2细胞中，补加400 μ Lopti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。
[0061] 3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。
[0062] 2. 2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平
[0063] I) TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：
[0064] 转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml TRIzol，充分混合室温裂解细胞 3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4°C、12, 000转离心15分钟。取 上层水相并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温沉淀10分钟。于4°C、 12, 000转离心10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇。于4°C、12, 000离心5分钟。 充分弃上清，室温晾干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。
[0065] 2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：
[0066] 在PCR管中加入如下反应体系，
[0069] 轻柔混合混匀，置于37°C反应15分钟，然后置于85°C加热5秒钟灭活逆转录酶。
[0070] 3)荧光定量qRT-PCR检测
[0071]