一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产活疫苗的方法，尤其是涉及一种用细胞系生产鸡传染性喉气 管炎活疫苗的方法，属于兽用生物制品技术领域。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性喉气管炎（AILT)是一种接触性呼吸道传染病，病原为喉气管炎病毒，可 感染不同年龄的鸡。目前发病年龄有提前的趋势，最早可见20日龄的鸡群发病，呈地方流 行性，发病率高达90%以上，死亡率10~40%。对养禽业的发展有较严重的危害性。
[0003] 鸡传染性喉气管炎病毒（AILTV)属于疱疹病毒属α亚科，其生物学特性和基因 结构与人的单纯疱疹病毒（HSV)较相似，如基因结构特征、分子量大小、同源特性等特点。 AILTV与HSV具有如此多的相似之处，使得较多学者针对HSV本身的特性进行AILTV的生物 学方面的探索。
[0004] 目如，对AILT的防控主要以疫苗的免疫接种为主，其中弱毒疫苗应用的效果最为 理想。但在实际应用中，弱毒疫苗所用病毒存在毒力偏强，易于返祖，对鸡易形成潜伏性感 染的弊端；在疫苗的实际生产中，主要使用SPF鸡胚进行ILT活疫苗的生产，而自2006年起 农业部规定所有的禽用活疫苗及几个猪用活疫苗等全部使用SPF胚后，使得SPF鸡胚接受 了较大的挑战，其鸡胚使用量远远超过了其供给能力，SPF胚供应存在豁口；对SPF鸡胚的 质量监测方面也存在一定的缺陷，这是因为是通过检测SPF鸡群的微生物结果来判定，但 由于检测仍不成熟，使得监测仍存在困难，从而导致SPF胚的纯净性存在一定的问题，无法 得到用户的全面认可；另外由于SPF鸡群饲养水平处于发展阶段，SPF鸡群的培育，饲养人 员日常操作管理等方面都存在不确定因素，导致SPF胚批间的差异性的存在成为必然。SPF 鸡胚存在如此多的缺点，不得不让我们去寻求新的培养方法。
【发明内容】
[0005] 本发明为克服现有技术缺陷、提供了一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗 的方法，它可以解决目前生产鸡传染性喉气管炎活疫苗方面存在的问题，
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的。
[0007] -种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其选用细胞系代替鸡胚进行 鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，步骤如下：
[0008] (1)筛选鸡传染性喉气管炎病毒培养细胞系：根据鸡传染性喉气管炎病毒生物学 特性，选取ΒΗΚ-21细胞、Vero细胞、DFl细胞、原代鸡胚成纤维细胞（CEF)、鸡胚肝细胞或鸡 胚肾细胞，前两种细胞采用DMEM培养液进行培养，后四种细胞使用Μ199培养液，分别进行 所述病毒的培养，得病毒株适应性细胞；
[0009] (2)筛选细胞的克隆纯化：对步骤⑴中所得的病毒株适应性细胞用8%胎牛血清 培养液进行稀释，稀释浓度为2个细胞/ml，加入48孔细胞板中，0. 3ml/孔进行细胞克隆培 养，选取细胞生长均一、轮廓清晰、透亮，细胞内无杂质的细胞孔进行消化冻存备用；
[0010] ⑶制苗细胞的传代、培养：
[0011] (4)病毒株的克隆、培养：采用步骤（2)中的克隆细胞进行病毒株的蚀斑克隆培 养，共克隆四次，一次克隆分别选取三个最小蚀斑，分别进行后三次的克隆，最终分别繁殖 克隆三个毒株，筛选出毒力最弱、免疫原性最强的制苗毒株，并对所述毒株进行适应性培 养；
[0012] (5)制苗用毒液的制备：用M199培养液对步骤（4)制苗毒株进行稀释，接种于长 满单层的制苗细胞中，于培养箱中吸附，待吸附后弃去稀释液，补加细胞维持液，进行病毒 的培养，最终收获细胞悬液备用；
[0013] (6)疫苗的配制及分装：收获步骤（5)中的制苗毒液，加入保护剂，充分混匀，定量 分装；
[0014] ⑵冻干。
[0015] 上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤（1)中，所述鸡传染性 喉气管炎病毒为K317株。
[0016] 上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤（2)中，所述细胞生长 液为M199,所用血清为8~12 %胎牛血清，培养PH为7. 0~7. 4 ;所述细胞经3~5次单 克隆培养处理，条件为，细胞：细胞孔=2 :1。
[0017] 上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤（3)中，细胞传10~15 代。
[0018] 上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤（5)中，制苗毒液采用 PH值为7. 4~7. 6的100% M199营养液进行稀释，以Ig尿囊膜中加入1ml所述营养液的 方式获得ILT病毒原液，最终以0. 5~1%接种量接种；病毒吸附的时间为1~2小时；所 述制苗细胞维持液为97% M199营养液和3 %胎牛血清，PH值为7. 4~7. 6。
[0019] 上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤(6)中，所述保护剂为 10 %~15%的脱脂牛奶蔗糖。
[0020] 本发明为克服现有AILT活疫苗制备上存在的不足，通过大量的实验研究，成功筛 选出ILTV适应性细胞系进行ILT活疫苗的制备，并应用于生产，成功替代现有使用鸡胚的 生产方式。与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
[0021] (1)通过有限稀释法和优等细胞筛选法，对筛选的病毒适应性细胞一一鸡胚肝细 胞进行克隆纯化、传代培养，最终筛选出病毒适应性好，细胞状态优良，并可连续传10~15 个代次的传代鸡胚肝细胞；
[0022] (2)通过蚀斑纯化技术和有限稀释法的有效结合，筛选出免疫原性好，毒力低，不 易返祖并稳定增殖的制苗毒。
[0023] (3)用传代细胞生产鸡传染性喉气管炎活疫苗，降低了生产成本，减少了疫苗免疫 副反应问题，缩小了批间差异性，保证了疫苗质量的稳定，并为实现所述病毒的规模化培养 奠定了基础。
[0024] 实验表明，本发明克隆方法仅通过3次克隆便可获得无细胞内杂质、透亮、圆润、 轮廓清晰的细胞，而现有方法需要克隆7次，可见本方法缩短了克隆时长，并在克隆中具有 高活性及高几率的克隆几率。
【附图说明】
[0025] 图1是不同细胞系培养鸡传染性喉气管炎病毒的培养细胞图
[0026] 图2是本发明的技术路线图
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0028] AILTV K317株由中国兽药监察所提供。
[0029] BHK_21、Vero、DFl三种细胞均购自中国兽药监察所。
[0030] CEF、鸡胚肝、鸡胚肾三种细胞均由申请人制备。
[0031] BHK-21和Vero细胞的培养使用DMEM培养液，CEF、DF1、鸡胚肝、鸡胚肾细胞采用 M199培养液，细胞生长液中添加了 8%~12%的胎牛血清，细胞维持液中添加了 3%~5% 的胎牛血清。
[0032] 实施例1筛选病毒适应性细胞
[0033] 1细胞的选取
[0034] AILTV与HSV同属于疱疹病毒属α亚科，特性有较多的相似之处，据相关报道HSV 可在BHK细胞、Vero细胞等多种细胞中生长良好，为筛选AILTV适应性细胞，本发明选择 ΒΗΚ-21和Vero细胞进行AILTV的繁殖。DF1、原代CEF细胞、鸡胚肝和肾细胞的选择主要根 据ILTV宿主特异性强的培养特性进行选择。
[0035] 2细胞的制备及传代
[0036] CEF、鸡胚肝、鸡胚肾三种细胞是鸡胚原代细胞，分别用去除眼球的整个鸡胚、剪碎 的鸡胚肝、捣碎的鸡胚肾经2. 5%胰酶（100单位/ml的双抗，PH为7. 5~7. 8)消化，加入 M199生长液制备；DFl、BHK-21、Vero细胞经0. 25%胰酶分散消化传代，分别加入细胞生长 液，置于培养箱中培养。
[0037] 3病毒的适应培养
[0038] 将AILTV接种于长满单层的CEF、DF1、鸡胚肝、鸡胚肾、BHK-21、Vero细胞瓶中，同 时设空白对照，吸附1~2h后补加细胞维持液，置于5% C02培养箱中培养，每天观察病变 情况，培养至第4天，收获细胞培养物，反复冻融，保存备用。采用收获的细胞培养物重复上 述步骤进行接种，共传10代。
[0039] 4观察及测定结果
[0040] 细胞接种病毒后进行CPE观察，同时采用PCR和免疫荧光法（IFA)跟踪检测，最终 对P8~PlO代培养物进行滴度测定，结果如表1所示。
[0041] 表1病毒适应性培养测定及观察结果
[0042]
[0043] 注释："一"为没有测出数值。
[0044] 5 结论
[0045] 对选择的六种细胞进行病毒适应性筛选，通过细胞的传代培养、CPE的观察、PCR 和IFA的检测及病毒滴度的测定，最终筛选出有CPE病变、IFA和PCR检测为阳性，并测得 具有稳定病毒滴度的病毒适应性细胞一一鸡胚