一种用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种用于骨修复的可注射并可自愈合的天然壳聚糖水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]高分子水凝胶(hydrogel)作为一种典型的含有三维网络结构的“软、湿材料”，因其特有的粘弹性、高含水性和环境响应性等特性而在组织工程、药物缓释以及生物传感器等生物医学领域具有广泛的应用前景。近年来，可注射水凝胶作为一类新型智能水凝胶，不仅可以在靶向位点原位自主发生溶液-凝胶转变，而且具有以微创介入方式注入体内的可注射性、修复或连接组织的形状自适应性、填充复杂形状的病灶部位等特性，在生物医学领域得到了越来越多的关注和研究。天然多糖中氨基与醛基发生可逆希夫碱(Schiff base)反应，生成可逆的亚胺键，使得高分子水凝胶能够原位自我修复，达到原位自愈合，恢复原有的力学和生物学性能。
[0003]壳聚糖作为一种阳离子聚电解质，含有大量的氨基。由于其具有良好的生物相容性、生物降解性，且来源广泛、价格低廉而倍受从事生物医用水凝胶研究的科学工作者的关注。但是，壳聚糖的溶解性不好，而改性后的乙二醇壳聚糖在保留原有优良性能的基础上，溶解性大大增强，作为生物医用材料使用时具有较大优势。海藻酸盐作为一种从天然褐藻中提取的天然线性多糖，其原料易得，并以其良好的生物相容性广泛应用于生物医学领域。并且，利用高碘酸盐对海藻酸钠进行部分氧化，可在海藻酸盐的结构中引入大量醛基。利用天然多糖中氨基与醛基发生的可逆动态反应，可在模拟生理学环境下生成亚胺键，实现水凝胶的自愈合。新型可注射的磷酸钙骨水泥，与人骨的无机成分相似，由于具有很好的生物相容性、可降解性和骨传导性，被广泛用于骨质疏松症及骨质疏松性骨折的治疗。
[0004]本发明将乙二醇壳聚糖与具有骨传导性性能的磷酸钙骨水泥复合后，与醛基功能化海藻酸钠进行动态可逆希夫碱反应，生成可逆的亚胺键，从而开发出一种具有可注射和自愈合双重功能的适用于骨修复的天然高分子水凝胶，有望能够更好地用于骨质疏松、骨折、骨缺损等骨组织疾病的治疗与修复。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的制备方法，其主要利用复合有磷酸钙骨水泥的乙二醇壳聚糖与醛基功能化的海藻酸钠在磷酸盐缓冲溶液中进行希夫碱反应，生成动态可逆的亚胺键，从而构建出一种可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶，所得天然高分子水凝胶具有良好骨修复功能，在骨修复等领域具有良好的应用前景。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的制备方法，其是先将海藻酸钠与可溶性高碘酸盐经氧化反应生成醛基功能化海藻酸钠，然后将氢氧化钙与磷酸反应生成磷酸钙骨水泥，再将磷酸钙骨水泥与乙二醇壳聚糖复合后，与醛基功能化海藻酸钠在磷酸盐缓冲溶液中进行希夫碱反应，制得所述天然高分子水凝胶。
[0007]所述用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的具体制备方法包括如下步骤:
步骤一:醛基功能化海藻酸钠的制备
1)在烧瓶中加入黏度为150?400mpa*s的海藻酸钠，加去离子水使其完全溶解，并在另一烧杯中将可溶性高碘酸盐用水完全溶解，再将所得可溶性高碘酸盐溶液缓慢加入至海藻酸钠溶液中，于25°C黑暗条件下磁力搅拌反应6?8小时；
2)反应完成后，将过量乙二醇加入所得溶液中，磁力搅拌0.5?1.5小时以除去未反应的高碘酸盐，然后将其放入截留分子量为3000的透析袋中，在去离子水中进行透析，6小时换一次水，透析3天后冷冻干燥，得到醛基功能化海藻酸钠；
步骤二:磷酸钙骨水泥的制备
1)室温搅拌下将氢氧化钙完全溶于水，再逐滴加入磷酸溶液，于60°C下磁力搅拌15?18小时，然后反复用超纯水洗涤、离心处理3次，冷冻干燥，得到磷酸钙骨水泥；
2)将所得磷酸钙骨水泥溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，200W下超声处理2小时后移入高压灭菌锅中，于120°C下灭菌处理30分钟，再将所得磷酸钙骨水泥溶液的浓度调整至 0.12 ?0.15g/mL ；
步骤三:天然高分子水凝胶的成型
1)将乙二醇壳聚糖溶液与步骤二所得磷酸钙骨水泥溶液充分混合均匀，得复合的乙二醇壳聚糖溶液；
2)将复合的乙二醇壳聚糖溶液与步骤一所得醛基功能化海藻酸钠混合；
3)将所得混合液于25°C下涡旋震荡20?60s至均匀，然后置于37°C水浴中静置2分钟，得到所述天然高分子水凝胶。
[0008]步骤一操作I)中所用海藻酸钠与可溶性高碘酸盐的摩尔比为1: 0.5?I ;所述可溶性高碘酸盐为高碘酸钠、高碘酸钾中的一种或两种。
[0009]步骤二操作I)在氢氧化I丐溶液中滴加磷酸溶液后，混合溶液中的I丐磷摩尔比为1.67:1ο
[0010]步骤二操作I)中所述冷冻干燥的处理温度为-10°c?-80°c。
[0011]步骤三操作I)中磷酸钙骨水泥的用量为所得天然高分子水凝胶重量的4%。
[0012]步骤三操作2)是按复合的乙二醇壳聚糖中的氨基与醛基功能化海藻酸钠中的醛基的摩尔比为1:0.5?I，将复合的乙二醇壳聚糖溶液与醛基功能化海藻酸钠混合。
[0013]步骤三操作3)中，所得天然高分子水凝胶中复合的乙二醇壳聚糖与醛基功能化海藻酸钠的总重量百分比为5~20%。
[0014]本发明采用复合有磷酸钙骨水泥的乙二醇壳聚糖与醛基功能化的海藻酸盐发生动态可逆希夫碱反应，制备出一种具有骨修复功能的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶。其中，乙二醇壳聚糖中的氨基基团与醛基功能化的海藻酸盐中的醛基基团在37°C的磷酸盐缓冲溶液中交联形成动态共价化学键一一亚胺键，其具有动态可逆的反应特征，属于热力学平衡反应体系。它不仅在一定程度上保持了共价键的性质较为稳定，而且又具有可逆性，在一些如PH、交联时间、温度等外界因素的影响下，键的断裂和形成可达到动态的可逆平衡，为本发明水凝胶的自愈合提供了物质基础。同时，本发明所用与乙二醇壳聚糖复合的可注射的磷酸钙骨水泥与人骨的无机成分相似，在37°C的磷酸盐缓冲溶液中具有很好的生物相容性、可降解性和骨传导性。因此，本发明制备的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的三维网络结构中始终存在着未被束缚的活性基团，可以在骨损伤处重新发生交联，同时结合磷酸钙骨水泥的诱导骨增殖的性能，为水凝胶的可注射、自愈合和骨修复提供了条件。
[0015]本发明将可注射和自愈合的概念融入到天然高分子水凝胶的材料设计中，根据动态共价化学理念制备具有骨修复功能的天然高分子水凝胶。这类水凝胶可通过成型反应物的交联反应和化学键的动态热力学平衡实现自愈合性能。同时，该水凝胶可利用注射器注入靶向部位，并按照病灶形状自动交联成为一个整体，填充到整个靶向部位中。
[0016]本发明采用天然高分子材料壳聚糖和海藻酸盐作为水凝胶骨架，其生物相容性好，同时将复合有磷酸钙骨水泥的乙二醇壳聚糖溶液与醛基功能化的海藻酸盐溶液在室温下混合即可原位形成水凝胶，在骨修复领域具有良好的应用前景。
【具体实施方式】
[0017]—种用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的制备方法，其是先将海藻酸钠与可溶性高碘酸盐经氧化反应生成醛基功能化海藻酸钠，然后将氢氧化钙与磷酸反应生成磷酸钙骨水泥，再将磷酸钙骨水泥与乙二醇壳聚糖复合后，与醛基功能化海藻酸钠在磷酸盐缓冲溶液中进行希夫碱反应，制得所述天然高分子水凝胶。
[0018]所述用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的具体制备方法包括如下步骤:
步骤一:醛基功能化海藻酸钠的制备
1)在烧瓶中加入黏度为150?400mpa.s的海藻酸钠，加去离子水使其完全溶解，并在另一烧杯中将可溶性高碘酸盐用水完全溶解，再按海藻酸钠与可溶性高碘酸盐的摩尔比为1:0.5?I将所得可溶性高碘酸盐溶液缓慢加入至海藻酸钠溶液中，于25°C黑暗条件下磁力搅拌反应6?8小时；
2)反应完成后，将过量乙二醇加入所得溶液中，磁力搅拌0.5?1.5小时以除去未反应的高碘酸盐，然后将其放入截留分子量为3000的透析袋中，在去离子水中进行透析，6小时换一次水，透析3天后冷冻干燥，得到醛基功能化海藻酸钠；
步骤二:磷酸钙骨水泥的制备
1)室温搅拌下将氢氧化钙完全溶于水，再逐滴加入磷酸溶液，使混合溶液中的钙磷摩尔比为1.67:1，然后于60°C下磁力搅拌15?18小时，再反复用超纯水洗涤、离心处理3次，于-10°C?_80°C下冷冻干燥，得到磷酸钙骨水泥；
2)将所得磷酸钙骨水泥溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，200W下超声处理2h后移入高压灭菌