一种被可注射水凝胶包裹的生长因子多孔微球复合系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属神经组织修复用生物医学材料领域，具体涉及一种被可注射水凝胶包裹 的生长因子多孔微球复合系统。
【背景技术】
[0002] 周围神经缺损及修复一直是困扰世界众多人的疾病之一，多由横断伤、烧伤或者 变性疾病等所致。周围神经损伤可分为断端无缺损损伤和断端有缺损两类。对于断端间无 缺损的损伤可采用外膜吻合，束膜吻合等手术方法进行吻合修复。而长段的周围神经缺损 的修复和功能重建仍然是临床的难题之一，严重影响了患者的生活质量。上个世纪以来，利 用非生物性导管治疗周围神经缺损成为研究热点，以硅胶为代表的不可降解材料由于其长 期滞留原地，可诱发周围组织的炎症反应，也会导致大量的瘢痕产生。以聚乳酸为代表的可 降解神经导管材料虽然可达到与自体神经移植类似的效果，但是对于长段的神经缺损则不 能够支持神经再生，并且由于异物的植入不可避免的产生炎症反应，影响的手术的成功率 及术后的恢复。这可能是由于缺少生长因子等内部基质作为支持组织的缘故，因此在神经 导管内置促进神经生长及修复的物质是非常必要的。
[0003] 神经生长因子（NGF)是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神 经细胞生长调节因子。研究表明，NGF在神经损伤处有大量表达，它对神经细胞的增殖、神 经元的再生及分化等均具有一定的促进作用。碱性成纤维生长因子（bFGF)又称为真皮生 长因子，对神经外胚层的细胞具有广泛的生物学活性，能够改善细胞生活微环境，促进受损 神经的再生，是神经细胞营养和再生因子，有"细胞激活因子"之称。经过人们的长期探索 发现，联合应用神经生长因子和碱性成纤维生长因子能够促进神经干细胞的分裂增殖，增 加神经干细胞向神经元分化的比例。然而，与bFGF 10h的半衰期相比，NGF的生物学半衰 期太短，且容易受其他物质的影响而失去活性，限制了其使用范围。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是要提供一种被可注射水凝胶包裹的生长因子微球 复合系统、制备方法及应用。该复合系统能够在生理条件下降解并缓慢释放出生长因子，实 现了生长因子在体内的缓慢释放，解决了生长因子释放过快、作用周期过短的问题，从而达 到神经修复的作用。，为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0005] -种被可注射水凝胶包裹的生长因子多孔微球复合系统的制备，其包括以透明质 酸（HA)与己二酸二酰肼（ADH)交联得到的HA-ADH溶胶作第一组分，和负载在第一组分中 的载有生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球。
[0006] 按上述方案，所述载有生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球中生长因子的质量百 分比为 4wt% -12. 5wt%。
[0007] 按上述方案，所述的生长因子为神经生长因子NGF和碱性成纤维生长因子bFGF， 其质量比为8. 5-11. 5 :1。
[0008] 按上述方案，HA-ADH溶胶与载有生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球混合质量比 为 1 :1· 25-5. 75。
[0009] 按上述方案，所述的HA-ADH溶胶是将透明质酸（HA)与己二酸二酰肼（ADH)在酸 性条件下以及HXVNHS活化剂的活化作用下0-4°C反应得到的得到的。
[0010] 按上述方案，所述的透明质酸与己二酸二酰肼的质量比为1 :2-6,所述的酸性条 件为 pH 为 4. 5-5. 75。
[0011] 按上述方案，所述载有生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球的平均直径为 2 it 1 μ m〇
[0012] 按上述方案，所述的载有生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球是以添加有致孔剂 和乳化剂的含有生长因子的溶液为内水相，以PLLA为油相，以含有乳化剂的溶液为外水 相，使用W/0/W复乳法得到复乳，然后搅拌均匀，静置固化，离心收集沉淀，洗涤，冻干获得。
[0013] -种被可注射水凝胶包裹的生长因子多孔微球复合系统的制备方法如下：
[0014] (1)将透明质酸（HA)与己二酸二酰肼（ADH)在酸性条件下以及EDC/NHS活化剂的 活化作用下得到HA-ADH溶胶；
[0015] (2)以添加有致孔剂和乳化剂的含有NGF和bFGF组分的溶液为内水相，以聚乳酸 (PLLA)为油相，以含有PVA的溶液为外水相，使用W/0/W复乳法得到复乳，然后搅拌均匀，静 置固化，离心收集沉淀，洗涤，冻干获得负载生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球；
[0016] (3)将上述步骤得到的HA-ADH溶胶与负载生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球搅 拌均匀即可。
[0017] 按上述方案，所述步骤（2)的W/0/W复乳法为：将PLLA溶于二氯甲烷中，得到油 相，然后加入到添加有致孔剂和乳化剂的含有生长因子的水相中，在搅拌或超声的条件下 形成w/0/w型乳液，然后再向其中加入含有乳化剂的外水相，高速搅拌一段时间成复乳。使 用W/0/W复乳法，获得负载生长因子的聚乳酸（PLLA)多孔微球，可避免亲水性的生长因子 向连续相渗漏而附着于微球表面，造成突释的问题。
[0018] 按上述方案，所述步骤（2)中生长因子的包封率为55_65wt%。
[0019] 按上述方案，步骤（1)反应时间为18-24h。
[0020] 按上述方案，步骤（2)中的冻干时间为24-48h，固化时间为80-120min。
[0021] 按上述方案，步骤（3)搅拌温度为0-4°C。
[0022] 按上述方案，步骤（2)水相中聚乳酸（PLLA)与致孔剂的用量比为1 :0. 67-0. 89， 聚乳酸（PLLA)与乳化剂的用量比为1 :1-1. 33,外水相中聚乳酸（PLLA)与乳化剂的用量比 为 1 :0· 53-0. 71〇
[0023] 按上述方案，所述步骤（2)致孔剂为碳酸钠（Na2C03);乳化剂为聚乙烯醇（PVA)， PVA相对数均分子量为35000-50000。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 1.生长因子的缓释性
[0026] 本发明将聚乳酸制成多孔微球负载生长因子，提高了生长因子的载药量和稳定 性，然后将该载药多孔微球负载在HA-ADH溶胶中，将其用HA-ADH溶胶包裹后，得到的被可 注射水凝胶包裹的生长因子微球复合系统，一方面：可在人体生理环境下转变为凝胶状态， 由此，对聚乳酸多孔微球具有良好的包裹及固定作用，另一方面，在生理条件下，聚乳酸分 子链发生化学分解变为小分子，在此过程中其包含的生长因子药物逐渐释放进入体液，初 始阶段药物释放缓慢，随着后期聚乳酸的迅速降解，释药速度不断增加。由此可实现药物的 均匀缓慢释放，同时可避免与组织的直接接触而造成粘连和突释。
[0027] 2. NGF和bFGF的协同性
[0028] 神经生长因子（NGF)是神经系统中最重要的生物活性物质之一，对神经系统的正 常发育及促进再生等方面均具有重要的生物学作用。碱性成纤维生长因子（bFGF)又称为 真皮生长因子，对神经外胚层的细胞具有广泛的生物学活性，能够改善细胞生活微环境，促 进受损神经的再生，是神经细胞营养和再生因子，有"细胞激活因子"之称。研究表明，联合 应用神经生长因子和碱性成纤维生长因子能够促进神经干细胞的分裂增殖，增加神经干细 胞向神经元分化的比例。然而，与bFGFlOh的半衰期相比，NGF的生物学半衰期太短，且容 易受其他物质的影响而失去活性，限制了其使用范围。本发明复合微球系统可实现这两种 生长因子的缓慢稳定释放，克服了 NGF生长因子半衰期短以及易遭受化学破坏的缺点，可 基于神经生长因子和碱性成纤维生长因子的联合作用达到更好的比单独使用NGF更好的 促进缺损神经修复的作用。
[0029] 3.神经修复过程的保护性
[0030] 透明质酸水凝胶能够在手术中作为粘连性手术器械，在手术期间保护组织，并给 手术提供一个让出空间和移动组织的安全工具；手术后，在手术部位，该水凝胶即变成粘连 性手术植入物，保证受损神经与其他组织表面分开，提供一个防止手术后粘连的屏障。透明 质酸作为理想的天然保湿因子，在术后能牢固的保持98%的水分，为神经的修复提供了良 好的微环境。透明质酸的包裹使得聚乳酸载药多孔微球均匀分散，避免了微球与受损神经 的直接接触，使得药物均匀缓慢的得到释放。
[0031] 4.良好的生物相容性
[0032] 透明质酸（HA)作为一种广泛存在于体液及组织中的粘多糖，被认为是一种填充 空间、稳定结构、涂层细胞和保护细胞的多糖，其主要作用是稳定细胞间纤维