一种无细胞多糖真皮基质材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及主要涉及生物工程领域，特别是一种无细胞多糖真皮基质材料及其制 备和应用。
【背景技术】
[0002] 无细胞基质（acellular dermal matrix, ADM)是利用物理、化学、生物等方法将 皮肤中的表皮层及含抗原成分的细胞彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质而 得到的，其具有抵抗原性、良好的生物学性能、良好的力学性能，是理想的生物材料，异种 (猪）无细胞真皮基质相对异体无细胞真皮基质具有来源广泛，价廉质优的优点，并且在胶 原含量、编制结构上与人体皮肤具有很高的组织同源性并且高度相似，经过改性和交联可 以进一步降低其抗原性、提高力学性能、增加材料抗菌性，具有巨大的应用前景。
[0003] 甲壳素是一种分布极广，易于提取的高分子聚合物，存在于虾、蟹等甲壳动物的甲 壳以及细菌、昆虫藻类和高等植物的细胞壁中，壳聚糖是甲壳素脱乙酰度在60%以上的产 物是一种线性、半晶体状多糖羧甲基壳聚糖是壳聚糖的衍生物，通过引入羧甲基等小的化 学基团，使其在中性和碱性环境中具有良好的水溶性，同时不影响壳聚糖的固有特性。羧甲 基壳聚糖与壳聚糖相比具有更好的保水性、生物相容性、粘附性、抗菌性、生物降解性和低 毒性，同时羧甲基壳聚糖可以加速成纤维细胞增殖、促进创面愈合，这些优良性质使羧甲基 壳聚糖更适合作为生物医用创面修复材料，具有广泛的应用前景。
[0004] 硫酸软骨素（CS)是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，它广泛 分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，具有抗凝血作用。将其复合在基质表面能够增 加敷料的生物相容性，利于细胞粘附增殖，加速创面愈合。
[0005] 透明质酸又名玻尿酸、HA，是一种酸性粘多糖，属于高分子聚合物，是由N-乙酰 葡糖胺和D-葡萄糖醛酸通过糖苷键连成的，这种多糖具有高保水性，可以起到保持细胞水 分，保护细胞不受病原菌的侵害，防止感染，同时可加快皮肤组织的恢复，提高创口愈合再 生能力。在基质上复合透明质酸，可提高敷料的创面修复能力，加速上皮化，调控胶原合成， 有效减少瘢痕形成，使愈合后的组织更接近正常皮肤。
[0006] 生物材料相对于合成材料具有生物相容性好，易于细胞附着和生长的优点，但其 同时具有降解速率过快、微结构不易控制、力学强度不足的缺点。如专利CN1387923A公 开了一种异种无细胞真皮支架及其制备方法，该支架系用胰蛋白酶和戊二醛处理乳猪皮而 得，这种方法处理后的真皮支架具有抗张强度高、生物相容性好的有点，但其渗透性差，创 面易产生积液、积气，血管化慢。专利CN1343523A公开了一种可用作创面修复的微孔异体 或异种无细胞真皮替代物，采用机械或激光的方法在无细胞真皮上规则地打上密集的贯穿 性的孔，这虽然可以解决无细胞真皮替代物的渗透性差的缺点，但是孔径过大或过密，会增 加抗原位点的暴露和抗原提呈细胞等接触ADM的机会，导致细胞相容性差，并且会一定程 度上破坏胶原支架的结构。专利CN1775189A公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法。该 脱细胞真皮基质是将哺乳动物皮肤依次用氢氧化钠溶液和去污剂处理后得到的产品，这种 方法处理后的脱细胞真皮基质具有组织相容性好、降解性好的优点，但是其抗张强度有待 提1?，抗菌性能不足。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种具有低抗原性、优良的生物 相容性、良好的力学性能和优良的抗菌性的无细胞多糖真皮基质材料的制备方法。
[0008] -种无细胞多糖真皮基质材料：在所述无细胞多糖真皮基质上复合水溶性多糖， 所述水溶性多糖包括羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸三种共同组成。
[0009] 它首次采用了将羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸三种物质联合复合的方法， 一种无细胞多糖真皮基质材料的制备方法具体还包括步骤如下：
[0010] (1)选用经过消毒封装的猪无细胞真皮基质（PADM)，并准确称重作为以下各工序 的计料依据；
[0011] (2)复合羧甲基壳聚糖：将制好的PADM放入转鼓中，将与PADM材料质量比为 1. 5~3. 0 :1、温度25~45°C、pH值5. 5~6. 0、质量浓度为0. 50~1. 20%的羧甲基壳聚 糖溶液，分次加入转鼓，反应30分钟后调节pH值到4. 5~5. 5,再反应60~90分钟，调节 pH值到6. 5~7. 0,处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用与其质量比为4. 0 :1的蒸馏 水水洗2次，每次15分钟，洗后控干水；
[0012] (3)戊二醛交联：在温度25°C，pH值3. 0~5. 0的条件下向步骤⑵所得材料加 入与PADM材料质量比为2. 0 :1的质量浓度为0. 1~0. 20%戊二醛溶液，分次加入，逐步调 节pH值到8. 0,反应30~60分钟，取出材料，用蒸馏水水洗至pH值为7. 0~7. 3 ;
[0013] (4)复合硫酸软骨素：将与PADM材料质量比为1.5~3. 0:1、温度25~45°C、质量 浓度为〇. 80~1. 00%硫酸软骨素溶液，分次加入加有步骤（3)产物的转鼓中，反应60分钟 后，调节pH值到6. 0~7. 0,再将处理后的材料用与其质量比为2. 0 :1的蒸馏水水洗2次， 每次15分钟，洗后控干水；
[0014] (5)复合透明质酸：将l.OOg透明质酸充分溶解于醋酸溶液中，稀释至100ml，制成 浓度为1.00% (w/V)的溶液，将复合了羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素后的无细胞真皮基质材 料离心脱水，使其体积含水量在70~90%，然后用小喷瓶将透明质酸溶液喷涂到无细胞真 皮基质材料表面，喷涂量是〇. 5~lg/m2 ;
[0015] (6)PBS液清洗：在温度25°C下用与上述所得材料质量比为3. 0 :1的PBS溶液冲洗 3次，每次30分钟。
[0016] (7)封装：材料装袋封口；
[0017] (8)消毒：将封装好的材料用钴-60 lOOGy剂量照射消毒，放入-4°C无菌环境保 存。
[0018] 上述的无细胞多糖真皮基质材料的应用：该材料添加功能性材料可用来制备生物 敷料、复合移植支架、组织工程表皮支架，其中所述功能性材料为抗菌剂、抗真菌剂、伤口愈 合剂、生长因子、皮肤基底膜形成促进剂、甘油中。例如，在该材料中添加体积含量为1. 0~ 3. 0 %的甘油，则制成抗菌生物敷料，把其一面贴于创面则可以起到保护创面、吸收体液的 医用目的。例如，在无细胞多糖真皮基质材料中添加3~6 μ g/m2的生长因子，8~12 μ g/ m2的皮肤基底膜形成促进剂、1. 0~3. 0%的甘油则制成有抗菌效果的人工表皮支架。
[0019] 无细胞真皮基质材料具有较强的抗张强度，为细胞提供了适合的生长空间，有利 于细胞的自然生长于排列，羧甲基壳聚糖具有良好的保水性、生物相容性、粘附性、抗菌性、 生物降解性和低毒性，同时羧甲基壳聚糖可以加速成纤维细胞增殖、促进创面愈合。硫酸软 骨素（CS)具有抗凝血作用，将其复合在基质表面能够增加材料的生物相容性，利于细胞粘 附增殖，加速创面愈合。透明质酸具有高保水性，可以起到保持细胞水分，保护细胞不受病 原菌的侵害，防止感染，同时可加快皮肤组织的恢复，提高创口愈合再生能力。在基质上复 合透明质酸，可提高材料的创面修复能力，加速上皮化，调控胶原合成，有效减少瘢痕形成， 使愈合后的组织更接近正常皮肤。
[0020] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0021] 1.无细胞多糖真皮基质材料具有良好的降解性。实验表明羧甲基壳聚糖用量对敷 料体外降解时间有一定的影响，随着羧甲基壳聚糖用量的增加，敷料的体外降解时间增长， 材料具有完全降解性。
[0022] 2.无细胞多糖真皮基质材料具有良好的透水汽性。实验表明随着羧甲基壳聚糖用 量的增加，敷料的透水汽速率增加，羧甲基壳聚糖的使用提高了材料的透水汽性，数据表明 羧甲基壳聚糖用量在〇. 〇〇~1. 50%之间时，材料的透水汽速率在3400~3700g. m 2. 24h 1之间，透水汽速率明显得到提高。
[0023] 3.无细胞多糖真皮基质材料具有高孔隙率的优点。随着羧甲基壳聚糖用量的增 加，敷料的孔隙率增加，当羧甲基壳聚糖用量在〇. 〇〇~1. 50%时，该材料的孔隙率在73~ 82 %之间，材料的孔隙率得到了明显增强。
[0024] 4.无细胞多糖真皮基质材料具有优良的拉伸强度。随着羧甲基壳聚糖用量的增 加，敷料的拉伸强度明显增强。当羧甲基壳聚糖用量在〇. 〇〇~1. 50%时，该材料的拉伸强 度在9. 40~10. 80MPa之间。
[0025] 5.无细胞多糖真皮基质材料具有高抗菌性能。实验表明，没有符合羧甲基壳聚糖 的材料，抗菌率为3. 10%，当材料复合了 1. 00%羧甲基壳聚糖后，材料的抗菌率大于70%， 说明材料具有良好的抗菌性能。
[0026] 6.无细胞多糖真皮基质材料具有广阔的用途。我们可以根据不同的要求将无细胞 多糖真皮基质材料制备成生物敷料、复合移植支架、组织工程表皮支架。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明的生产工艺流程图；
[0028] 图2为敷料粒面图SEMX500 ;
[0029] 图3为敷料粒面图SEMX 1000。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述。实施例1 :
[0031] 本实施例提供一种制备无细胞多糖真皮基质敷料的方法，采用以下步骤制备：
[0032] (1)选用经过消毒封装的猪无细胞真皮基质（PADM)，并准确称重作为以下各工序 的计料依据；
[0033] (2)复合羧甲基壳聚糖：将制好的无细胞真皮基质放入转鼓中，在温度40°C，pH值 6. 0的条件下，分次加入与PADM材料质量比为2. 5 :1的质量浓度为1. 00 %羧甲基壳聚糖溶 液，反应30分钟后调节pH值到5. 0,再反应60分钟后，调节pH值到7. 0。再将处理后的材 料用蒸馏水水洗2次，每次15分钟，洗毕控干水；
[0034] (3)戊二醛交联：在温度25°C，pH值5. 0的条件下加入与PADM材料质量比为2. 0 的