一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明属于生物膜制备技术领域，特别涉及一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用。
【【背景技术】】
[0002]牙周炎是人类牙齿丢失的首要病因。牙周组织再生是牙周病治疗的最终目的，但传统的牙周洁治和刮治等基础治疗，只能消除病因，不能修复已经丧失的牙周组织。引导组织再生术牙周治疗中的常用方法，是在牙周手术中利用膜性材料作为屏障，阻挡牙龈上皮在愈合过程中沿根面生长，阻挡牙龈结缔组织与根面接触，并提供一定的空间，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面，从而在已暴露于牙周袋内的根面上形成新的牙骨质，并有牙周膜纤维埋入，形成牙周组织的再生，即形成新附着性愈合。
[0003]用于引导组织再生术的膜性材料可分为两类:不可吸收性膜和可吸收性膜。B1-Gide胶原膜为一种可吸收生物膜，不需要二次手术取出，它能有效阻挡牙龈结缔组织长入牙周膜，有利于牙周膜细胞形成新的附着。但是，对于一些重度牙周炎患者，B1-Gide膜引导组织再生的程度往往不甚理想，一部分原因是重度牙周炎患者其牙周膜及牙槽骨等牙周组织丧失过多，很难引导其恢复到正常水平，另一部分原因是局部的厌氧环境使得生物膜易于被细菌污染，从而造成手术失败。
[0004]牙周膜干细胞是从牙周膜组织中分离出的具有多向分化潜能的干细胞，该细胞可分化成牙周的三种组织:牙槽骨、牙周膜和牙骨质，被认为是牙周组织工程的首选种子细胞。将牙周膜干细胞接种到B1-Gide膜用于牙周引导组织再生术，可提高引导组织再生术后牙周组织再生的程度。因此，功能性的接种牙周膜干细胞的B1-Gide复合生物膜具有非常可观的临床应用前景。
[0005]然而，在该复合生物膜植入早期，其内部缺乏新生的血管，膜内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持。如何能够保证膜内的牙周膜干细胞能够保持良好的活性和功能状态，并改善局部的厌氧环境，提高牙周组织再生术的成功率，成为了目前一个急需要解决的问题。
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【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于提供一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用，该生物膜可提高牙周组织再生的效率，解决了现有生物膜引导牙周组织再生时出现的早期氧供不足问题。
[0007]本发明解决技术问题所采用的技术方案包括以下步骤:
[0008]一种引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，包括以下步骤:
[0009]分别培养牙周膜干细胞及制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液，将二者混合制成每毫升全氟三乙胺乳液中104_108个干细胞的细胞-全氟三乙胺乳液，将制得的细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上培养，终止培养后，即得到引导牙周组织再生术生物膜。
[0010]作为本发明的进一步改进，所述的培养牙周膜干细胞的步骤具体为:
[0011]1.1)人牙周膜细胞原代培养:取因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为l_Xl_Xlmm的组织±夬，用lmg/mL的I型胶原酶置于37°C消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10% FBS和青链霉素的α -MEM培养基，置于37°C、5% C02饱和湿度条件的培养箱中，培养10-15天，每2天换液，待细胞达到80%融合时，胰酶消化传代；
[0012]1.2)分离和纯化人牙周膜干细胞:用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞:取步骤1.1得到的细胞用α -MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为ΙΟ/mL以下，接种于96孔板，每孔0.lmL，放入37°C、5% C02饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液；当细胞形成克隆并长至孔底40%时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。
[0013]作为本发明的进一步改进，还包括步骤1.3)人牙周膜干细胞的鉴定:将经步骤1.2)培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验；要求细胞的克隆形成率高于12%，免疫化学染色STR0-1和CD146阳性率高于30%，流式细胞术分析STR0-1和⑶146阳性率高于85%，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。
[0014]作为本发明的进一步改进，所述的制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液的步骤具体为:
[0015]2.1)称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为15%?16.6%的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于280W?320W功率下，超声乳化1?3次，每次超声10?20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备得基础乳液；
[0016]2.2)另取全氟三乙胺原液，将经步骤2.1)制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按20:1-1:20的体积比混合，于280W?320W功率下，超声乳化8?12次，每次超声10?20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
[0017]2.3)、将经步骤2.2)制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内8min?12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；
[0018]2.4)、采用滤膜孔径不大于0.65 μ m的滤器对经步骤2.3)处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌富氧的全氟三丁胺乳液。
[0019]作为本发明的进一步改进，所述的制备细胞-全氟三乙胺乳液的步骤具体为:将培养状态良好的牙周膜干细胞，加入到制备的全氟三乙胺乳液中，制成每毫升104_108个细胞的全氟三乙胺乳液，即细胞-全氟三乙胺乳液。
[0020]作为本发明的进一步改进，所述的生物膜片上培养步骤具体为:将剪成1.5cmX 1.5cm生物膜片置于24孔板上，取细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上，培养8-48h后终止培养。
[0021]作为本发明的进一步改进，所述的生物膜片为B1-Gide胶原膜。
[0022]作为本发明的进一步改进，所述的全氟三乙胺原液质量浓度大于98%。
[0023]上述的方法制得的引导牙周组织再生术生物膜。
[0024]一种引导牙周组织再生术生物膜在牙周病损部位引导牙周组织再生中的应用。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0026]本发明一种引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，选择生物膜、全氟三丁胺(Perfluorotributylamine, PFTBA)水凝胶及牙周膜干细胞，其中将PFTBA作为增氧剂，为植入B1-Gide胶原膜内的牙周膜干细胞提供早期的氧供，提高了牙周膜干细胞的存活率，保持了牙周膜干细胞的活性和功能，从而最大限度的发挥引导牙周组织再生的能力，促进了牙周组织的再生和恢复。本发明的引导牙周组织再生生物膜制备方法通过改善膜内的乏氧环境，在提高牙周膜干细胞植入后早期的存活效率的同时，抑制局部厌氧菌的滋生，极大的降低了引导组织再生术的失败率，提高了成功率，具有很好的经济和社会效益。
[0027]本发明一种引导牙周组织再生术生物膜，采用牙周膜干细胞的复合可提高牙周组织再生的效率，采用全氟三乙胺解决了现有生物膜引导牙周组织再生时出现的早期氧供不足问题。
[0028]应用本发明的引导牙周组织再生生物膜在进行引导牙周组织再生术的过程中，牙周膜干细胞可分化为牙周组织，提高了本生物膜促进牙周组织再生的效率。
【【附图说明】】
[0029]图1是本发明的制备方法原理图。
[0030]图2是本发明的再生膜可显著促进牙周组织愈合验证对比图。
【【具体实施方式】】
[0031]如图1所示，本发明的全氟三乙胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生术生物膜制备方法，具体按照以下步骤实施:
[0032]步骤1、人牙周膜干细胞的培养与纯化:
[0033]1.1人牙周膜细胞原代培养:取12-45岁之间因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，立即在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为1mmX 1mmX 1mm大小的组织块，用I型胶原酶(lmg/mL)置于37°C消化30min，将组织块均勾接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10% FBS和青链霉素的α -MEM培养基，置于37°C、5% C02饱和湿度条件的培养箱中，培养10-15天，每2天换液。待细胞达到80%融合时，胰酶消化传代。
[0034]1.2分离和纯化人牙周膜干细胞:用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞:取上述细胞用α -MEM制成单细胞