胚胎fyn相关底物efs在防治肠道病毒71型感染中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠 道A类病毒，是导致手足口病（Hand-foot-mouthdisease,HFMD)的主要病原体之一。目 前，手足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市 暴发手足口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100 万例，死亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、 足、臀部以及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神 经系统（centralnervoussystem，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以 及神经源性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[SolomonT，LewthwaiteP，Perera D,CardosaMJ,McMinnP,OoiMH.Virology,epidemiology,pathogenesis,andcontrolof enterovirus71.LancetInfectDis.2010Nov;10(ll) :778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型（EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特 异高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003]EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，这也是导致手足口 病患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee，K. K. ,etal.Evolutionarygeneticsofhumanenterovirus71:origin,population dynamics,naturalselection,andseasonalperiodicityoftheVPlgene.J Virol, 2010. 84(7) :p. 3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够 检测到EV71基因及抗原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液循环感染CNS需要穿越 血脑屏障，然而病毒如何穿过血脑屏障侵入CNS的机制还不清楚。血脑屏障（BloodBrain Barrier，BBB)是位于循环系统和中枢神经系统之间一道主要的屏障，它限制着不同物质在 两个部位之间的自由运输，对维持CNS的体内平衡以及保护CNS免受外界病原微生物的侵 袭中起着至关重要的作用[DyrnaF，HanskeS,KruegerM，BechmannI.Theblood-brain barrier.JNeuroimmunePharmacol. 2013 ;8 (4) : 763-73.]。血脑屏障是由无窗孔的脑微 血管内皮细胞及其间的紧密连接、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个 细胞复合体。在这个细胞复合体中，最主要的物质结构基础是脑微血管内皮细胞（Brain MicrovascularEndothelialCells，BMECs)及其紧密连接，其严整性的丢失被认为是病毒 感染致脑组织损伤的一个重要原因。因此，探明EV71感染BMECs的机制并以此寻找新的 抗病毒靶点，对于保护血脑屏障的功能，以及防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重 要。
[0004] 在病毒感染宿主细胞的过程中，一系列广泛的宿主细胞信号通路会被激活。这 些信号通路可以为病毒所利用，从而实现病毒自身有效的入侵、复制、释放等生命过 程。随着研究的深入，这些被病毒利用的信号激酶分子已成为抗病毒治疗的重要靶 标。研究表明，EV71感染需利用多条信号通路及其调控系统，如在感染早期与受体作 用后，通过激活Rho家族分子来调节细胞骨架系统，促进病毒侵入（HussainKMl，Leong KL,NgMM,ChuJJ.Theessentialroleofclathrin-mediatedendocytosisinthe infectiousentryofhumanenterovirus71.JBiolChem. 2011 ；286(1):309-21.)； 激活P13K/Akt和MAPK/ERK信号通路，促进病毒进一步增殖并引发炎症反应；通过刺 激细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclindependentkinase5，Cdk5)途径来诱导细胞 凋亡等(TungWH,HsiehHL,YangCM.Enterovirus71inducesC0X_2expressionvia MAPKs,NF-kappaB,andAP-linSK-N-SHcells:RoleofPGE(2)inviralreplication. CellSignal. 2010, 22 (2) :234-46.)。然而，目前关于EV71感染BMECs所引发的信号通路 及所利用的信号调节分子仍不清楚。
[0005] 蛋白酪氨酸激酶（proteintyrosinekinase，PTK)及其调节分子是重要的 细胞信号转导激酶，能够调节多种细胞生理功能，同时也被证实参与调节多种病毒对 宿主细胞的感染过程（PelkmansL，FavaE，GrabnerH，HannusM，etal.Genome-wide analysisofhumankinasesinclathrin-andcaveolae/raft-mediatedendocytosis. Nature. 2005, 436 (7047) : 78-86.)。如受体酪氨酸激酶衔接蛋白Grb2主要调节下游 信号ERK通路以及PI3K/Akt通路，参与调节了鼠白血病病毒MLV的感染过程（Chen Z,KolokoltsovAA,WangJ,etal.GRB2interactionwiththeecotropicmurine leukemiavirusreceptor,mCAT-l,controlsvirusentryandisstimulatedbyvirus binding.JVirol. 2012, 86 (3) : 1421-32.)。衔接相关蛋白复合物API(adaptor-related proteincomplex1)能够偶联酪氨酸激酶信号，调节内吞以及高尔基体转运功能。促细胞 分裂原磷酸化蛋白DAB(mitogen-responsivephosphoprotein)能够与受体酪氨酸激酶衔 接蛋白Grb2作用后调节Ras信号通路。CBL泛素连接酶能够与多种酪氨酸磷酸化分子作 用介导了蛋白的泛素化降解。Ezrin蛋白可通过酪氨酸激酶信号调节细胞微管系统，继而 调节了细胞黏附与迀徙等生理过程；Ezrin蛋白也被证实参与了丙型肝炎病毒感染肝细胞 的过程（BukongTN,KodysK,SzaboG.Humanezrin-moesin-radixinproteinsmodulate hepatitisCvirusinfection.Hepatology. 2013, 58(5):1569-79.)〇
[0006]酪氨酸激酶FYN(FYNproto-oncogene,Srcfamilytyrosinekinase)属于 非受体型Src家族酪氨酸激酶分子（GeneAccession:NM_153048)，广泛表达于各种组织 细胞中，尤其是在脑组织中高表达。FYN参与调节多种细胞生理功能以及细胞癌变的过 程。研究发现FYN也参与了多种病毒的感染过程，如柯萨奇病毒在感染宿主细胞时需激 活FYN来完成有效入侵（CoyneCB，BergelsonJM.Virus-inducedAblandFYNkinase signalspermitcoxsackievirusentrythroughepithelialtightjunctions. Cell. 2006, 124(1) :119-31.) 〇
[0007]胚胎FYN相关底物EFS(EmbryonalFYN-associatedsubstrate)为酪氨酸 激酶FYN的相关衔接蛋白（GeneAccession:NM_005864)它能够结合Src家族酪氨酸 激酶的SH3结构域从而介导了一系列的胞内信号转导（DonlinLT,RomanCA,Adlam M,etal.Defectivethymocytematurationbytransgenicexpressionofa truncatedformoftheTlymphocyteadaptermoleculeandFYNsubstrate,Sin.J Immunol. 2002, 169(12) :6900-9.)。该基因具体的功能研究相对较少，在病毒感染过程中的 作用未见报道。
[0008] 目前还没有任何关于FYN以及EFS分子在EV71感染HBMEC中作用的研究报道，对 于FYN以及EFS分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可以为 预防与治疗EV71感染提供新的思路与靶点。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。
[0010] 本发明的另一目的在于提供EFS分子的新用途，特别是在抗肠道病毒71型感染中 的应用。
[0011] 本发明的第三目的在于提供干扰EFS分子表达的siRNA。
[0012] 本发明的主要技术方案是：
[0013] 本发明，以人脑微血管内皮细胞（HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶 细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人脑微血管内皮细胞（HBMEC)的宿主 因子，从而保护血脑屏障的功能。本实验选择了一组宿主细胞酪氨酸激酶及其调节分子 来进行筛选，这些分子在宿主细胞的酪氨酸激酶信号转导通路调节中发挥着重要作用， 它们往往也是在病毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。这些分子包括：衔接 蛋白API(AP1M2)、2型DAB蛋白（DAB2)、CBL泛素连接酶（CBL、CBLB、CBLC)、酪氨酸激酶 FYN(FYN)、Ezrin蛋白（VIL2)、ERC1 (ELKS)、胚胎FYN相关底物EFS(EFS)、酪氨酸激酶衔接 蛋白Grb2(GRB2)。通过检索NCBIGeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源 及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计 siRNA，通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。
[0014] 我们发现FYN以及EFS分子在EV71感染HBMEC中发挥着重要的作用，下调FYN或 EFS分子的表达，能明显抑制EV71的感染。
[0015] 本发明的第一方面，提供了胚胎FYN相关底物EFS(EmbryonalFYN-associated substrate，EFS)，即蛋白酪氨酸激酶FYN的相关衔接蛋白EFS作为一种抗肠道病毒71型感 染的新靶点
[0016] 本发明的第二方面，提供了胚胎FYN相关底物EFS在制备预防或治疗肠道病毒71 型感染药物中的应用。