肌醇磷脂4位激酶二型α亚型特异抑制剂PI-273的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肌醇磷脂4位激酶二型α亚型 (ΡΙ4ΚΙΙ α )特异抑制剂ΡΙ-273的应用。
【背景技术】
[0002] 肌醇磷脂（PI)信号通路在跨膜信号转导和多种生长因子和激素调节细胞生长 的信号通路中起核心作用。肌醇磷脂4位激酶ΡΙ4Κ是PI信号通路中第一个起重要作用 的激酶，在肌醇磷脂循环过程中ΡΙ4-Κ首先催化肌醇磷脂（PI)环上D4位磷酸化，产生 4_磷酸磷脂酰肌醇（4-phosphatidyl-inositide, PIP)，然后由ΡΙΡ5-Κ激酶进一步催化合 成（4, 5-phosphatidyl-inosidide diphosphate, PIP2) ;PIP2 在磷脂酶 C(Phospholipase C，PLC)的作用下水解为三磷酸肌醇（l，4,5-trisphosphoinositol，IP3)和甘油二酯 (Diacylglycerol，DAG)，作为第二信使，引发胞内f丐释放和激活蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)，启动细胞内的双信使系统。另外，PIP2也是PI3-K的底物，因而PI4K影响 PI3-K信号通路。近年研究发现PIP，PIP2本身也具有重要生物学功能。因此，PI4K是PI 信号通路中的关键分子，关于PI4K的功能研究引起了人们越来越多的关注。
[0003] PI4K激酶与许多人的重要疾病如癌症、疟疾、阿尔兹海默症和糖尿病等相关。其中 PI4KII α是磷脂酰肌醇信号通路和磷脂酰肌醇代谢中的关键分子，在PIP2生物合成、溶酶 体和高尔基体相关膜转运、细胞内信号通路传导、病原体吞噬和神经突触囊泡循环等方面 起着重要作用。
[0004] 目前已经报道了增加 ΡΙ4ΚΙΙ α的表达会促进肿瘤的生长以及通过联合抑制EGFR 和PMKIIa的表达来治疗EGFR依赖的肿瘤。PMKIIa在Wnt和Akt信号通路也有重要作 用。然而，与ΡΙ3Κ激酶家族的大量研究相比，对ΡΙ4Κ的基础研究和临床应用却很少，主要原 因之一是缺少ΡΙ4Κ激酶家族的特异抑制剂。在已有的PIK家族的小分子抑制剂除了 ΡΙΚ-75 是PI底物竞争抑制剂其余绝大部分ATP竞争抑制剂。由于PIK家族不同亚型的核酸结合 口袋有高度保守的氨基酸序列，小分子抑制剂很难区分抑制不同亚型的激酶。亚型特异的 抑制剂通过减少脱靶效应从而减小毒性。因此，发现PI底物竞争的抑制剂可以解决这个问 题。另外，越来越多的证据表明，除了 ΡΙ3Κ激酶，其他的PIK激酶和磷酸酶如ΡΙ4ΚΙΙ a、 ΡΙ4ΚΙΙΙβ、PMKIIIa、ΡΙΡ5Κ1α和INPP4B影响癌症的发生，所以发现不同PIK激酶亚型 特异抑制剂会极大的促进肿瘤发生机制的研究及其治疗。
[0005] 最近解析了人源ΡΙ4ΚΙΙ α结合ADP形式的晶体结构，确认出不同于ΡΙ3Κ的核酸 结合口袋和PI结合口袋。其中棕榈酰化插入片段通过影响PI结合口袋影响PI4KII α酶 活性，而棕榈酰化插入片段并不存在于其他PIK激酶中，所以棕榈酰化插入片段是特异抑 制剂筛选的理想位点。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供PI-273的用途。
[0007] 本发明提供了 PI-273作为PI4KII α酶抑制剂中的应用；
[0008] ΡΙ-273的化学结构式为式1 :
[0010] 式 1。
[0011] 上述ΡΙ-273在制备抑制ΡΙ4ΚΙΙ α酶活性的产品中的应用也是本发明保护的范 围。
[0012] 上述ΡΙ-273在制备PMKIIa的可逆抑制剂中的应用也是本发明保护的范围；
[0013] 或上述ΡΙ-273在制备PMKIIa的PT竞争性抑制剂中的应用也是本发明保护的 范围。
[0014] 上述PI-273在制备抑制磷脂酰肌醇信号通路的产品中的应用也是本发明保护的 范围。
[0015] 上述应用中，所述抑制磷脂酰肌醇信号通路通过抑制PI4KII α酶活性实现。
[0016] 上述PI-273在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0017] 上述PI-273在制备抑制肿瘤的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0018] 上述应用中，
[0019] 所述抑制肿瘤体现在如下1)-4)中至少一种：
[0020] 1)抑制肿瘤细胞增殖；
[0021] 2)使肿瘤细胞阻滞在细胞周期的G2/M期；
[0022] 3)促进肿瘤细胞凋亡；
[0023] 4)抑制肿瘤细胞成瘤能力。
[0024] 上述PI-273在制备具有如下1)_4)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明 保护的范围：
[0025] 1)抑制肿瘤细胞增殖；
[0026] 2)使肿瘤细胞阻滞在细胞周期的G2/M期；；
[0027] 3)促进肿瘤细胞凋亡；
[0028] 4)抑制细胞成瘤能力。
[0029] 本发明另一个目的是提供一种如下1)_8)中至少一种功能的产品。
[0030] 本发明提供的产品，其活性成分为PI-273 ;
[0031] 1)预防和/或治疗肿瘤；
[0032] 2)抑制肿瘤；
[0033] 3)抑制肿瘤细胞增殖；
[0034] 4)使肿瘤细胞阻滞在细胞周期的G2/M期；；
[0035] 5)促进肿瘤细胞凋亡；
[0036] 6)抑制细胞成瘤能力。
[0037] 7)抑制 PI4KII α 酶活性；
[0038] 8)抑制磷脂酰肌醇信号通路。
[0039] 上述肿瘤为乳腺癌；上述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。
[0040] 上述动物为小鼠。
[0041] 本发明的实验证明，本发明首次根据人源PMKIIa的晶体结构筛选出其亚型特 异的小分子抑制剂ΡΙ-273。用酶动力学方法确定ΡΙ-273是PMKIIa底物PI的竞争性抑 制剂。利用突变分析和抑制剂与PMKIIa的对接模型，确定ΡΙ-273通过与PMKIIa蛋 白棕榈酰化插入片段（Pal insertion)相互作用从而抑制PMKIIa的酶活性。体内和体 外实验显示PI-273亚型特异的抑制PI4KII a的酶活性。在细胞水平上PI-273通过抑制 PI4KII a酶活性从而抑制磷脂酰肌醇信号通路。PI-273可以阻断细胞周期G2/M期抑制肿 瘤细胞增殖，诱导凋亡及抑制细胞成瘤能力。动物水平上在对实验小鼠没有毒性的情况下， PI-273显著性的抑制MCF-7诱导的肿瘤组织的生长。PI4KII a亚型特异的抑制剂PI-273 提供了乳腺癌治疗的新策略。
[0042] 下面通过实施例来更好说明和理解本发明，但本发明的保护范围不限于实施例的 范围。
【附图说明】
[0043] 图1为PI4KII a小分子抑制剂的筛选；
[0044] a. PI-273和PI-69的化学结构式；
[0045] b.用PI4K激酶活性检测方法检测不同化合物对PI4KII α体外酶活抑制效果，化 合物对乳腺癌细胞MCF-7，Hs 578Τ，T-47D细胞系处理3天后检测对细胞增殖能力的抑制效 果；
[0046] c.用1 μ M和3 μ M PI-273处理MCF-7细胞2天后收取细胞检测PI4P的含量变 化。
[0047] 图2为PI-273直接结合PMKIIa并可逆的抑制PMKIIa酶活性；
[0048] a.表面等离子共振实验检测PI-273与PI4KII α的相互作用，PI-273从1. 25 μM 到20 μ M等梯度稀释；
[0049] b.蛋白热稳定性实验检测PI-273与PMKIIa的相互作用，不同浓度的PI-273和 PI-69与5 μΜ PMKIIa蛋白处理后，分析PMKIIa蛋白稳定性变化；
[0050] c.利用细胞热转移分析实验确定PI-273与ΡΙ4ΚΙΙ α的相互作用，用1 μΜ PI-273 处理MCF-7细胞96小时和20 μ M PI-273处理细胞裂解液用30分钟；
[0051] d.将PMKIIa与不同浓度梯度的PI-273 (0-1 μ M)预孵育不同时间（0-60min);
[0052] e.加入不同浓度的PI-273 (0-2 μ Μ)测定不同PMKIIa酶浓度（2. 5-10ng/μ 1) 的反应初速率，以初速率对酶浓度作图。
[0053] 图3为PI-273是ΡΙ4ΚΙI α底物PI的竞争性抑制剂；
[0054] a.在不同浓度的底物ATP条件下，检测不同浓度的PI-273 (0-0. 8 μ M)下 ΡΙ4ΚΙΙ α的酶活性，求算Vmax和Km值；
[0055] b.在不同浓度的底物PI条件下，检测不同浓度的PI-273 (0-0. 4 μ Μ)下ΡΙ4ΚΙΙα 的酶活性，求算Vmax和Km值；
[0056] c. 5μΜ各突变蛋白与50μΜ ΡΙ-273处理后，用蛋白热稳定性实验检测蛋白溶解 温度的变化；
[0057] d.PI-273 与 PMKIIa 的结合模型。
[0058] 图4为PI-273选择性抑制PI4KII a酶活性；
[0059] a. PI-273和PI-294对32种不同激酶的选择性作用，激酶经对照DMS0, 5 μ M PI-273和5 μΜ PI-294处理后检测酶活性抑制效果。
[0060] b. PI-273和PI-294对选择的7种激酶的半数抑制浓度。
[0061] c. PI-273对过表达和干扰PMKIIa蛋白后细胞的增殖抑制效果。
[0062] d.在MCF-7细胞中PI-273特异调节HER2和AKT信号通路，MCF-7细胞经PI-273 处理3天，100ng/ml EGF或者Insulin处理10分钟，免疫印迹法检测HER-2和AKT的磷酸 化蛋白水平。
[0063] e. f. 1 μΜ PI-273或DMSO处理对照或者干扰PI4KII a的细胞3天后，检测PI4P 含量和AKT磷酸化的蛋白水平。
[0064] 图5为PI-273对乳腺癌细胞的抑制效果；
[0065] a.不同浓度的 PI-273 处理 MCF-7, T-47D，HS578T 细胞 24h，48h，72h 和 96h，用 CFDA SE实验检测细胞增殖效应；
[0066] b.不同浓度的PI-273处理MCF-7，T-47D，HS578T细胞48h后通过PI染色和流式 细胞仪分析细胞周期变化；
[0067] c. PI-273处理细胞48h，72h和96h后TUNEL检测细胞凋亡过程；
[0068] d. e. PI-273处理MCF-7，T-47D