一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和再生医学领域，具体涉及一种治疗系统性红斑狼疮的干细 胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多系统多器 官的自身免疫病，患者体内免疫系统功能紊乱，T、B淋巴细胞异常活化，产生多种自身抗体 和免疫复合物，导致患者皮肤、关节、肾脏等全身多个器官及系统受到损害。SLE好发于青年 女性，男女比例为1 :9,在我国成年女性中发病率为0. 1%，高于西方国家的0.05%，且随着社 会经济的发展及生活压力的增加，SLE的发病率日益上升，由于该病病程长且反复发作，给 患者的心理和生理带来了极大的影响。
[0003] SLE常用的治疗方法主要是通过服用糖皮质激素或免疫抑制剂等药物，以此来缓 解因免疫系统攻击正常组织所造成的炎症反应和抑制免疫系统的作用。虽然糖皮质激素与 免疫抑制剂被用于治疗系统性红斑狼疮使患者的预后有了明显改善，但是，SLE的治疗现状 仍不容乐观：①目前仍然有约10%的患者在发病5年内死亡；②由于疾病的进展及一些治 疗带来的副作用，如出现感染、骨髓抑制、骨质疏松、高血压、糖尿病等，尤其是细胞毒药物 及糖皮质激素的应用，SLE患者的平均寿命明显短于正常人群；③常规的治疗方法只能减 缓病情的发展速度，非根治疾病。因此，寻找一些高效、副作用少的新治方已迫在眉睫。
[0004] 自1996年开始用自体造血干细胞（HSC)移殖治疗SLE以来，在重症难治性SLE中 取得了较好的疗效，但存在易复发的问题，而异基因 HSC移殖治疗SLE虽能使部分患者病 情长期缓解，但供体来源不足，病死率高达30%~50%，且治疗费用高。骨髓中除了 HSC外 还存在一种形态上类似成纤维细胞的间充质干细胞（MSC)，MSC具有多向分化潜能、免疫 原性低与增殖速度快等特点。MSC不仅具有支持造血的功能，还具有免疫调节及诱导免疫 耐受的功能，研究表明MSC发挥免疫调节及诱导免疫耐受的机理主要是：抑制T细胞增殖， 使产生白细胞介素4( IL-4)的细胞数减少，产生干扰素 γ( IFN-γ)的细胞数增加，调节 Thl/Th2的平衡。MSC可通过多种途径调节炎症因子的释放、诱导免疫耐受、抑制自身免疫 反应从而达到长期有效地治疗SLE。但是由于单纯的骨髓干细胞群体中MSC的含量极少， 如果不通过体外的进一步扩增，很难达到治疗效果，且SLE是一种全身性疾病，单纯的使用 MSC治疗，治疗效果有限，特别是对于一些重症SLE患者来说，短期内难以达到良好的治疗 效果。
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种用于治疗SLE的干细胞制剂及其制备方 法，对干细胞治疗SLE具有特别重要的临床意义。
【发明内容】
[0006] 目前，SLE的治疗方法主要存在的问题与缺陷：①常规治疗方法副作用大、复发率 高、治疗效果不佳、对难治性SLE的治疗无效；②干细胞移殖作为新型疗法，自体HSC移殖 复发率高；异体HSC移殖配型难、死亡率高；③成体MSC移殖是目前最有效的治疗方法，其 免疫原性低，但数量有限，且由于SLE属于全身性疾病，单纯的采用MSC治疗，治疗效果有 限。为了解决上述问题与缺陷，本发明的目的是提供一种治疗SLE的干细胞制剂及其制备 方法，弥补SLE目前的治疗方法中存在的不足之处。
[0007] 本发明提供了一种用于治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂中干细胞制备方法，该 方法用特殊方法诱导和培养胚胎干细胞，制备成干细胞制剂，可以有效地提高和增强干细 胞治疗系统性红斑狼疮的疗效。
[0008] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤： (1) 胚胎干细胞的体外培养、扩增：采用胚胎干细胞的培养液将胚胎干细胞重悬后，调 整细胞密度为（1~3)X104/cm 2，接种于明胶包被的T175细胞培养瓶中，置于37°C、5%C0 2 培养箱中孵育，48小时后补液，72小时后换液。待细胞融合到85~90%时用0. 25%的胰蛋 白酶消化传代，按照1 :3~1 :5传代到IOOmm培养皿中，补足培养液继续培养，每2~3d用 消化液消化传代； (2) 诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化、培养、传代和检测：将步骤（1)中所得胚胎 干细胞的细胞浓度调整为5X IO5/皿接种到IOOmm培养皿中，每皿加入诱导体系8ml，将 培养皿置于37°C、5%C0 2进行诱导培养24h ;将经过诱导生后的干细胞更换培养液，采用 间充质干细胞培养液，待细胞长满后用〇. 25%胰蛋白酶消化传代，扩大培养至干细胞数为 IO8-IO9;用流式细胞仪对P3代诱导后的间充质干细胞进行鉴定：所述间充质干细胞表达 CD73、CD90、CD105 和 CD29,不表达 CD34 和 CD14 ; (3) 将步骤（2)制备的间充质干细胞与表皮生长因子（EGF)、白介素11 (IL-11)、人血 白蛋白按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成干细胞制剂； 其中，所述步骤（1)中的胚胎干细胞培养液的组成为：90%DMEM培养基，10%胎牛血清、 0.1 mmol/L0-疏基乙醇、lmmol/L L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，4ng/ml重组人碱性成纤 维生长因子； 所述步骤（2)中的诱导体系为：含10%胎牛血清、100ng/mL ActivinA的去除LIF、 2mmol/L L-谷氨酰胺、10 μ mol/L Y-27632 (Rho激酶抑制剂）的DMEM (高糖）培养基； 所述步骤（2)中间充质干细胞培养液的组成为：15%胎牛血清（FBS)，85%DMEM培养液； 所述步骤（3)中干细胞制剂的具体组成为：间充质干细胞的浓度为（4~6) XlOM^/ ml，EGF为8ng/mL，人血白蛋白的质量体积比为2%，IL-Il为30ng/mL，余量为生理盐水。
[0009] -种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂是由上述步骤制备而成的，其中由诱导后 的间充质干细胞、表皮生长因子（EGF)、人血白蛋白、白介素11 (IL-11)、生理盐水按一定比 例配制而成； 其中，所述干细胞制剂的具体组成为：间充质干细胞的浓度为（4~6 ) X IO7个/ml，EGF 为8ng/mL，人血白蛋白的质量体积比为2%，IL-Il为30ng/mL，余量为生理盐水。
[0010] 进一步的，所述间充质干细胞是由胚胎干细胞诱导分化而来。
[0011] 进一步的，所述胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的 一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
[0012] 本发明相对于现有技术具有以下优点和效果： (1)本发明首次将由人胚胎干细胞体外诱导培养出的间充质干细胞联合细胞因子使 用，进行SLE的治疗，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗SLE的方法。
[0013] (2)本发明通过将间充质干细胞联合细胞因子使用弥补SLE目前治疗方法中存在 的不足之处，其中：①间充质干细胞主要具有以下几个方面的优势：a多向分化潜能、能分 化出多种正常细胞修复机体受损组织；b免疫原性低，大大降低了发生移植物抗宿主病的 几率；c增殖速度快，制备容易，可以大规模产业化生产；d具有免疫调节及诱导免疫耐受的 功能，抑制T细胞增殖，调节Thl/Th2的平衡，抑制自身免疫反应从而达到长期有效地治疗 SLE。②EGF的优点：EGF的存在能诱导间充质干细胞向皮肤干细胞分化，75%的SLE病人都 在临床都表现出角质脱肩和毛囊栓、口腔溃疡、光过敏等皮肤受损现象，皮肤干细胞一方面 可向下迀移分化为表皮基底层，进而生成毛囊；另一方面则可向上迀移，分化为各种表皮细 胞，进而修复SLE患者的受损皮肤。③IL-Il的优点：50%SLE患者出现血小板减少，IL-Il 可以减少SLE患者病人因血小板减少而引起的出血与死亡。
[0014] (3)本发明提供的干细胞制剂输入SLE患者体内后，细胞能长期存活于患者体内， 起到了长期有效的治疗作用，避免了采用常规治疗方法时，患者需要长期服用各种免疫抑 制剂和激素类药物的缺点。
[0015] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如 后。本发明的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。
【附图说明】
[0016] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1是间充质干细胞生长曲线图，横坐标为培养天数，纵坐标为吸光度； 图2是狼疮小鼠的24尿蛋白定量检测图，图中分别显示了三组小鼠 AU A2、A3随着年 龄的增长，尿蛋白的变化情况，横坐标为检测时小鼠的年龄，纵坐标为尿蛋白含量； 图3是狼疮小鼠的体重增长记录，图中分别显示了三组小鼠 AU A2、A3随着年龄的增 长，体重的变化情况。横坐标为检测时小鼠的年龄，纵坐标为体重； 图4是三组小鼠 AU A2、A3在治疗前和治疗后抗双链DNA (dsDNA)抗体滴度测定图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将参考附图并结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。
[0018] 实施例1胚胎干细胞的体外培养： 将液氮中保存的胚胎干细胞于37 °C水浴，快速溶化，细胞悬液由固态变为液态。采用 DMEM培养基将胚胎干细胞重悬后，调整细胞密度为（1~3) X IOVcm2，接种于明胶包被的 T175细胞培养瓶中，置于37°C、5%C0 2培养箱中孵育，48小时后补液，72小时后换液。待细 胞融合到80~90%时用％0. 25的胰蛋白酶消化传代，按照1 :3~1 :5传代到IOOmm培养皿 中，补足培养液继续培养，每2~3d用消化液消化传代。
[0019] 实施例2诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化 体外培养获得胚胎干细胞的方法，同实施例1 诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化：将步骤（1)中所得胚胎干细胞悬液的细胞浓度 调整为5 X IO5/皿接种到IOOmm培养皿中，每皿加入诱导体系8ml，将培养皿置于37°C、5%C0 2进行诱导培养24h。所述的诱导体系为：含10%胎牛血清、100ng/mL ActivinA的去除LIF、 2mmol/L L-谷氨酰胺、10 μ mol/L