一种前列腺癌核酸疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种核酸疫苗，特别设及一种前列腺癌核酸疫苗。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌发病率在全世界范围内呈现增长趋势，成为人类健康的一大威胁。未发 生转移的前列腺癌通过化疗与放疗等治疗可W较为有效地抑制肿瘤发展，病人可W获得比 较理想的生存率。但对于复发和转移性前列腺癌，在经过传统的治疗方法后，绝大多数会发 展成为去势难治性前列腺癌（CRPC)，此时，现有的治疗手段无法有效地控制肿瘤发展，因而 患者的生存率非常低。因此，临床上急需要一种全新有效的治疗手段来治疗CRPC。
[0003] 在过去的十几年里，免疫治疗作为肿瘤治疗的新手段受到了越来越多的关注。其 中抗肿瘤DNA疫苗由于其独特的优势发展迅速，多种针对人类肿瘤的DNA疫苗已经进入了 临床试验阶段，有的已经被批准应用于动物肿瘤的治疗。前列腺癌的免疫治疗方法研究进 展相对缓慢，前列腺癌表达多种肿瘤相关抗原（TAA)，如前列腺特异性抗原PSA、前列腺特 异性膜抗原PSMA、前列腺酸性憐酸酶PAP、前列腺干细胞抗原PSCA等。运些肿瘤相关抗原 有可能为免疫治疗提供多种祀点。另外，前列腺癌患者血清中PSA浓度在早期便会发生变 化，运使得早期治疗成为可能。同时，循环血液中可W检测到与前列腺TAAs发生反应的T 细胞，运说明对运些抗原的自我耐受是可W克服的。肿瘤DNA疫苗的要达到的关键目标就 是引发机体的细胞介导的免疫反应，主要是激活肿瘤相关抗原（TAA)特异性的杀伤性T淋 己细胞（CTLs),然后运些抗原特异性的淋己细胞通过杀伤表达肿瘤相关抗原（TAA)的细胞 而达到治疗作用。运意味着如果DNA疫苗如果能引发机体足够强的免疫反应，攻克去势难 治性的前列腺癌将成为可能。要使DNA疫苗起到较好的效果，抗原的选择尤为重要。
[0004]W前列腺特异性抗原PSCA、PAP、PSM、PSA都含有前列腺癌免疫治疗的良好祀点 (表位）。但是，其各有优缺点，单独使用都能起到一定的作用，但效果不明显，且尚不知 PSCA、PAP、PSMA、PSA所含有的具体有功能的表位及其融合表达效果。
[0005] 如今，前列腺癌DNA疫苗已经从实验室实验进入了临床试验阶段，并且已经取得 了一定的进展，但是，目前的前列腺癌DNA疫苗应用于临床效果不明显，甚至只存在理论上 的效果，没有实际使用效果。
【发明内容】
[0006] 本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，通过前列腺癌抗原PSCA，PAP，PSMA，PSA 相关表位的融合制成一种前列腺癌核酸疫苗。
[0007] -种前列腺癌核酸疫苗，所述核酸疫苗由前列腺癌抗原PSCA，PAP，PSM，PSA的能 够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域融合而成，其上游融合表达化T化的 信号肤及胞外区，其下游融合表达CD40L。
[0008] 所述前列腺癌核酸疫苗的基因序列如核巧酸序列表SEQIDNO: 1所示。
[0009] 包含上述的前列腺癌核酸疫苗的质粒载体。
[0010] 所述质粒载体的原始质粒载体为pSVKl。
[0011] 包含上述的质粒载体的真核表达细胞。
[0012] 所述真核表达细胞的原始细胞为293T细胞。
[0013] 上述前列腺癌核酸疫苗在制备抗前列腺癌的药物中的应用。
[0014] 所述药物包括上述前列腺癌核酸疫苗和共刺激佐剂，所述共刺激佐剂包括细胞因 子，趋化因子和细菌毒素。
[0015] 优选的，所述细胞因子为细胞因子GM-CSF和B7. 1。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明设计了一种新型的将前列腺 癌4种常见抗原进行融合表达的核酸疫苗，同时辅W各种共刺激分子和分子内佐剂，提高 了该核酸疫苗的免疫原性，增强其抗肿瘤免疫效果。通过实验结果可W看出，该融合表达模 式的核酸疫苗，免疫后的小鼠能够同时诱导抗体反应和细胞免疫，并且单从数据来看，疫苗 组免疫后诱导的免疫反应非常强烈，尤其是能够诱导强烈的细胞免疫反应，运对于疫苗的 抗肿瘤效果是至关重要的。
【附图说明】
[0017] 图1是pU巧7-FL+4P+CD4化质粒双酶切鉴定图；
[0018] 图中，M:5000DNAmarke;1 :pUC57-FL+4P+CD40L质粒；2 :pUC57-FL+4P+CD40L质粒 BamHI和MfeI双酶切。
[0019] 图2是pVAX-GB质粒酶切线性化鉴定图；
[0020] 图中，M: 5000DNAmarke; 1 :pVAX-GB质粒；2 :pVAX-GB质粒BamHI和EcoRI双 酶切。
[0021] 图3是过渡疫苗质粒的酶切鉴定；
[0022] 图中，M: 15000DNAmarker;1:疫苗质粒；2 :疫苗质粒RneI+BamHI双酶切。
[0023] 图4疫苗质粒在293T细胞中瞬时表达的流式细胞术分析；
[0024]图中，A:对照组（門TC+P巧；B:实验组（CD154PE+CD80FITC)。
[0025] 图5是疫苗质粒免疫小鼠肌肉组织免疫组化结果；
[002引图中，A:生理盐水组小鼠；B:疫苗组小鼠（PSCA) ;C:疫苗组小鼠（PAP) ;D:疫苗 组小鼠（PSA)出：疫苗组小鼠（PSMA)。
[0027] 图6是ELISA检测各组小鼠血清中特异性抗体0D450皿值。
[0028] 图7是ELISPOT斑点图。
[0029] 图8是免疫后小鼠IFN- 丫的化ISPOT检测结果。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0031] 实施例1疫苗融合抗原的设计及表达质粒构建与制备 [00础实验材料；
[0033]含有佐剂分子GM-CSF(Genbank号：M11220. 1)，B7. 1(Genbank号：NM_005191. 3) 和内部核糖体进入位点IRES序列的质粒pVAX-IRES-(GM-CSF+B7),如序列表SEQIDN0:20 所示，（简称pVAX-GB)质粒为前期构建，在疫苗构建过程中作为过渡载体（该载体的构建 是将IRES, GM-CSF和B7. 1序列融合后全基因合成，然后通过BamH I和EcoR I酶切位点将 融合基因克隆入Invitrogen公司的pVAXl所构成）；用于疫苗构建的pSVKl空载体为前期 构建和保存（该载体是WInvitrogen公司的pSFVl质粒为基础改造，具体就是用CMV启动 子替换了SP6启动子，W卡那霉素抗性替换了原先的氨节西林抗性，改造后其全序列如序 列表SEQ ID NO: 21所示）；大肠杆菌E.COliD册a为本公司保存。
[0034] 连接酶试剂盒solution I为化kara公司产品；DNA限制性内切酶均购自肥B公 司；片段胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；DNA电泳用琼脂 糖购自Promega公司；转染试剂化transterTM-H为北京英格恩生物科技有限公司产品；PE 标记的抗人CD154 (CD40L)单克隆抗体和FITC标记的抗人CD80度7-1)单克隆抗体为Santa 化UZ公司产品；
[0035] 实验方法及结果：
[0036] 1.化-4P-CD4化融合基因的获得
[0037] 通过查阅文献，选择四个前列腺癌抗原：PSCA、PAP、PSMA、PSA，并进一步确定了运 四种抗原能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域，从中选择了 10条表位 (表1)，在设计祀抗原时我们依据运四种抗原天然蛋白在细胞中的空间定位，设计出了 4P 抗原（表2)。
[003引表1覆盖HLA-A2表位的区域[0039]
[0043] 同时，为了增强疫苗的免疫原性，在4P抗原的上游融合表达化T3L的信号肤及胞 外区，在4P抗原的下游融合表达CD40L融合基因的全序列由金唯智公司合成，全序列如序 列表沈QIDNO: 1所示。
[0044] 2.获取化-4P-CD4化融合抗原基因片段
[004引将由基因公司合成的质粒pU巧7-化+4P+CD4化用BamHI和MfeI双切后，切胶回 收2. 3化片段，即得到化-4P-CD4化融合基因，其双酶切鉴定结果如图1所示。
[004引 3.中间过渡DNA载体pVAX-GB的双酶切线性化
[0047] 将质粒pVAX-GB用BamHI和EcoRI双切将载体线性化然后切胶回收，酶切鉴定 图如图1所示。
[0048] 4.过渡疫苗质粒pVAX-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7 (简称过渡疫苗质粒）的构 建与酶切鉴定
[004引连接反应：在10y1反应体系中，加入5y1的solutionI，所得化-4P-CD40L片 段4y1，所得线性化的pVAX-GB片段1y1，16°C反应30min。
[0050] 连接产物转化：取100y1感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，向感受 态细胞悬液中加入10y1连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，立即转移到42°C水浴锅中热击 60s，迅速转移到冰浴中2min。向感受态细胞中加入500y1无菌的不含抗生素的LB培养 基，混匀后置于37°C中，200巧m震荡培养40min。取200y1已转化的感受态细胞均匀涂布 于含有氨节青霉素（IOOyg/mL)的固体培养基上，37°C倒置培养12-16小时。从平板中挑 取单一菌落约6个，分别接种于含氨节青霉素（100yg/mL)的LB液体培养基中巧mL/管）， 37°C，200巧m震荡培养过夜。
[0051] 根据质粒提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）的说明提取重组质粒，用 BamHI和RneI双切鉴定过渡疫苗质粒pVAX-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7,鉴定结果如图 3所示，凝胶电泳均得到与预期大小相符的目的片段，大小约为4200bp和3000bp。
[0052] 5.疫苗质粒pSVKl-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7的构建和鉴定（W下简称疫苗 质粒）
[0053] 酶切空载体pSVKl:用SmaI酶切pSVKl，将质粒pSVKl线性化，此时其酶切后其具 有两个平末端。
[0054] 化-4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7融合基因片段的获得：首先用BamHI对过渡 疫苗质粒pVAX-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7进行单酶切，纯化回收后补平，然后用 化eI对前一步得到的载体进行再次单酶切，经过该步操作即可获得两端均为平末端的 化-4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7 融合基因片段。
[00巧]载体pSVKl与化-4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7融合基因的连接与鉴定：
[0056] 将上述步骤中得到的分别具有两个平末端的pSVKl载体 化-4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7融合基因进行连