用离体扩增的脂肪组织源性干细胞进行脂肪植入来实现整容性乳房填充或面部填充和 ...的制作方法
【专利说明】用离体扩増的脂肪组织源性干细胞进行脂肪植入来实现整 容性乳房填充或面部填充和/或年轻化 发明领域
[0001] 本发明设及用离体扩增的脂肪组织源性干细胞或离体扩增的脂肪组织源性干细 胞富集型脂肪移植物进行软组织填充。运些可用于整容性乳房填充/增大或面部填充和/ 或年轻化。 阳〇〇引发明描述
[0003] 整形外科的一个常见的挑战是校正体积缺陷和增大现有体积。在校正体积缺陷时 或在增大现有组织时，使用填充材料（所谓的填料或插入物）往往是必需的。自体脂肪移 植（脂肪植入）能够修复并且增大软组织（例如整容性隆胸）并且越来越多地用于美容外 科与重建外科中。自体脂肪组织已被视为用于增大软组织的理想填料，因为它是生物相容 的、通用的、外观自然的、非免疫原性的、便宜的并且可轻易获得的，而且供体部位罹病率低 I'2。然而，移植的脂肪移植物具有不可预见的并且往往较低的存活率，运是研究者一直在寻 找增加其活力的新方式的原因。一项研究富集脂肪组织源性间质干细胞（ASC)的异种脂肪 移植的动物研究已表明所述技术是有效的并且可重现的，并且与非富集型相比使移植物的 剩余体积增加 3。近来的一项人类研究已表明并且证实了添加ASC至脂肪移植物中获得增 加的剩余体积和更佳质量的移植组织的优点和惊人的效果4。
[0004] 在整容行业中，可用于整容性面部填充/年轻化的解决方案主要是人造物（例如A 型肉毒毒素、玻尿酸、胶原蛋白、径憐灰石巧、聚乳酸、聚甲基-甲基丙締酸醋微球）。因此， 结果往往W因低通用性和生物相容性而看起来不自然而结束。人造填料随时间推移分解， 并且可能具有从各种疾病症状变化到美貌缺陷的有害物理副作用。如W上所描述，自体脂 肪组织被视为一种理想填料解决方案。然而，患者用自体脂肪进行面部填充/年轻化（即 在没有干细胞富集的情况下）处理的结局可能因不可预见的移植物存活率而W结果不成 比例而结束。 阳0化]一些外科医师提出可通过添加所谓的基质血管成分（SV巧至移植物中来实现更 好并且更可预测的移植物吸收5'6。SVF是当通过脂肪去除收获脂肪组织并且使用胶原蛋白 酶酶促消化脂肪细胞时所形成的细胞沉淀。SVF已知含有少量脂肪组织源性干细胞（ASC)。
[0006] 区别W下术语是重要的：
[0007] 1)常规脂肪植入：仅脂肪
[0008] 2)细胞辅助脂肪移植：脂肪+SVF
[0009] 扣干细胞富集型脂肪植入：脂肪+离体扩增的ASC
[0010] 4)干细胞填充：离体扩增的ASC
[0011] 在本专利申请中，我们仅设及W上术语3)和4。
[0012] 对本专利申请中所设及的干细胞的定义：
[0013] 当接种和培养基质血管成分时粘附于培养物表面的细胞。
[0014] 对于乳房与面部应用两者，可使用自体或异基因细胞。
[0015] 本发明尤其适合用于整容性面部填充和年轻化W及整容性乳房填充/增大。
[0016] 发明详述
[0017] 本发明设及一种组合物，其包含离体扩增的脂肪组织源性干细胞（ASC)或与收获 脂的肪组织W每毫升脂肪5,OX104-2,OX108、例如1，OX105-2,OXIO7个ASC的比率混合 的离体扩增的脂肪组织源性干细胞（ASC) ;W及离体扩增的脂肪组织源性干细胞或离体扩 增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物作为用于整容性乳房填充/增大或用于面部 填充/年轻化的药剂的用途。
[0018] 用于收获ASC的手术程序
[0019] 患者接受口诊患者微型脂肪去除。
[0020] 脂肪抽出物将通过标准无菌脂肪去除技术来收获。通过切口将湿润溶液渗透至皮 下脂肪中。使用标准脂肪去除装置（例如Vibrasa幡）获得脂肪抽出物并且封闭于无菌容 器中。将脂肪抽出物运送至临床干细胞实验室。
[0021] ASC的分离和培养
[0022] ASC分离和离体扩增将在经批准用于优良制造实践（GMP)和临床干细胞扩增的实 验室中在细胞治疗设备上根据经批准的方案进行。
[0023] 将脂肪抽出物用憐酸盐缓冲盐水（PB巧洗涂并且离屯、。为分离基质血管成分 (SVF)，解育上清液并且用胶原蛋白酶（GMP级）进行酶促消化。使用生长培养基来中和酶 活性。使用60-100ym过滤器过滤悬浮液并且离屯、。将细胞沉淀再悬浮于培养基中并且计 算沉淀中含有SVF的细胞的数目。分离SVF的替代方式是使用封闭系统，例如GIDSVF-r 系统。将SVF接种于由杜尔贝科氏改良伊格尔培养基值U化ecco'smodifiedEagle's medium,DMEM)和a最低必需培养基（Alphaminimalessentialmedium，a-MEM)、1-5% 青霉素-链霉素、1-5IU/血无防腐剂肝素W及2-20%汇集的人类血小板裂解物pH化或任 何其他替代生长培养基（例如胎牛血清）组成的培养基中。解育原代培养物（PO)。弃去非 粘附细胞，将细胞培养物烧瓶小屯、地用PBS冲洗，并且更换培养基。每3-7天改变培养基。 在培养期间和收获ASC的当天，将检查每个培养烧瓶/堆叠的病原体污染情况。
[0024] pH化制备 阳02引可如Schallmoser等人7所描述在进行微小修改的情况下制备抑PL。简言么在 知情同意之后，从健康的供血者收集全血单位。遵守现行法律，测试所有血液捐赠物的传染 性疾病标记物。将血沉栋黄层与红血细胞和血浆分离。将四个血沉栋黄层单位与1单位血 浆一起汇集至1单位富含血小板的血浆（PRP)中并且储存于-20°C至-80°C下。将最少十 单位的PRP在水浴中解冻并且然后汇集至单一批次的PRP中。将汇集后的PRP批料等分成 更小部分并且冷冻于-20°C至-8(TC下。接着，将来自单一批次的汇集后PRP的所有等分袋 在水浴中解冻并且离屯、（例如在4000g下持续15min)W使血小板片段沉积。最后，将含 pH化上清液转移至新的袋子中并且储存于-40°C至-80°C下W便随后在制备细胞培养基时 使用。 阳0%] ASC收获程序
[0027]ASC是在P0-P4中收获。将所有细胞培养物烧瓶/堆叠用PBS洗涂并且使用化学 (例如化ypleSelect)或物理加工将细胞从塑料表面分离。将含有ASC的悬浮液离屯、（例 如在300g下持续5min)，除出上清液并且在重悬浮于PBS中之后收集细胞沉淀。将ASC细 胞沉淀用PBS洗涂，将ASC离屯、并且在各洗涂程序之后弃去上清液。将细胞计数=次并且 将计算平均计数。在释放ASC用于临床用途之前将小屯、地控制ASC，包括I)不存在病原体 污染，2)ASC的活力大于90%，3)形态经评估为ASC的特性。ASC将在经批准的无菌容器中 进行运输。
[0028] 脂肪去除、移植物制备W及脂肪植入程序
[0029] 手术程序是在局部或全身麻醉下进行。通过标准无菌脂肪去除技术收获脂肪抽 出物。使用纯的渗透器通过切口将湿润溶液（例如克莱因斯溶液化Ieinssolution))渗 透至供体部位中。收获套管直径是2-5mm，并且具有纯的尖端，其连接至收获装置（例如 Vibrasat坂）。若需要，则使用生理盐水洗涂脂肪抽出物。所收获的脂肪抽出物留待进行沉 积、旋转或离屯、（例如在100g下持续5min)。在分离程序之后，倾析油层（上层）并且也将 水性层（下层）从注射器中排尽。使用主要由脂肪移植物组成的中间层来进行移植。
[0030] 所发明的应用：
[0031] 整容性到,房填充：将收巧的脂肪组织与收巧的离体扩增的ASCW每毫升脂肪 5, 0X104-2, 0XIO8个ASC的比率、优选W每毫升脂肪1，0X10 5-2, 0XIO7个ASC的比率混 合，并且W等分试样形式注射至乳房中来获得整容性增大。
[0032] 注射技术的实例：
[0033] 将富集型脂肪移植物使用长针水平地（平行于身体）注射至乳房中W免损坏乳房 组织外部的结构。针是从围绕乳晕边缘的若干个点和在乳房下皱葉处的若干个点沿可变方 向和平面插入，W实现移植物的看起来均匀并且自然的分布。
[0034] 对于而部填充巧皱纹巧巿：将收巧的胎化紀织与收巧的离体扩蜡的ASCW每毫升 脂肪5,OX104-2,OXIO8个ASC的比率、优选W每毫升脂肪1,0X10 5-2,OXIO7个ASC的比 率混合。干细胞的量将根据所需填充量的增加而增加，需要的填充越少，ASC的浓度越高。 若所要效果纯粹是组织质量改善的问题，则将单独使用ASC，其溶解于PBS中W使细胞均匀 分布。
[0035] 注射技术的实例：
[003