野木瓜总皂苷的制备工艺及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药提取物领域，具体涉及一种野木瓜总皂苷的制备工艺及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（Diabetesmellitus，DM)已成为危害全人类生命健康的慢性代谢紊乱疾 病，但由于临床上常用化学药物都伴有不同程度的不良反应，而天然药物具有综合治疗作 用、安全和几乎无毒副作用等多种优势，因此国内外学者都希望从天然产物中探寻出安全、 有效的降糖成分。DM发病主要为2型糖尿病（Type2diabeteSmellituS，T2DM)，达到总发 病率的90%以上，因此，寻找安全高效的治疗T2DM的天然药物更加刻不容缓。在众多具有 抗DM活性的天然产物中，齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的降糖活性受到了极大关注。
[0003] 野木瓜（StauntoniachinensisDC.)为木通科野木瓜属植物，富含齐墩果烧型三 萜皂苷，具有镇痛消炎，放射增敏，抗肿瘤，抗补体和促进神经细胞生长等作用。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是现有技术中缺少安全有效的治疗2型糖尿病的药物。 本发明为了开发一种安全有效的抗T2DM天然药物，更好地利用野木瓜资源，对野木瓜总皂 苷的提取工艺和抗糖尿病活性进行了研究。野木瓜总皂苷在制备抗糖尿病药物中应用未见 有相关报道。
[0005] 本发明从野木瓜藤茎中提取分离纯化得到野木瓜总皂苷，并采用IR的T2DM型 C57db/db小鼠为实验模型，探究野木瓜总皂苷体内抗T2DM活性及其机制。
[0006] 本发明提供的野木瓜总皂苷的提取方法，包括如下步骤：
[0007] (1)取野木瓜藤茎粉末以乙醇水溶液浸泡提取，提取液蒸干后，得到醇提物浸膏；
[0008] ⑵步骤⑴得到的醇提物浸膏以甲醇水溶液溶解后，以乙酸乙酯萃取，分别收集 上层乙酸乙酯萃取液和下层水相部分；
[0009] (3)步骤（2)的下层水相部分以正丁醇萃取，分别收集上层正丁醇萃取液和下层 水相部分，正丁醇萃取液蒸干后即得粗总皂苷；
[0010] (4)以大孔树脂纯化步骤（3)得到的粗总皂苷，得到野木瓜总皂苷。
[0011] 优选地，步骤（4)以大孔树脂纯化步骤（3)得到的粗总皂苷包括如下步骤：
[0012] a.采用HP20大孔树脂柱；
[0013] b.以水溶解野木瓜粗总皂苷，湿法上样；
[0014] c.对HP20大孔树脂柱进行洗脱，洗脱液浓缩、蒸干即得野木瓜总皂苷。
[0015] 优选地，步骤a中，野木瓜粗总皂苷与HP20大孔树脂柱的树脂的质量比为1:5~ 20 〇
[0016] 优选地，步骤c中，依次以用5~10倍柱体积的水、体积浓度为30%的乙醇水 溶液、体积浓度为50 %的乙醇水溶液和体积浓度为70 %的乙醇水溶液和无水乙醇依次对 HP20大孔树脂柱进行洗脱，合并体积浓度为50 %的乙醇水溶液和体积浓度为70 %的乙醇 水溶液的洗脱液，浓缩，蒸干即得野木瓜总皂苷。
[0017] 优选地，步骤（1)所述的乙醇水溶液为体积浓度60%的乙醇水溶液。
[0018] 优选地，步骤（1)的浸泡提取为浸泡3次，每次浸泡时间为24小时，合并浸泡提取 液，旋干得到醇提物浸膏。
[0019] 优选地，步骤（2)所述的甲醇水溶液为体积浓度10%的甲醇水溶液。
[0020] 优选地，步骤（2)中，醇提物浸膏以甲醇水溶液加热溶解，加热温度不高于75°C。
[0021] 本发明还提供野木瓜总皂苷用于制备抗糖尿病药物的应用：野木瓜总皂苷作为活 性成分与药学上可接受的载体或辅料制备成抗糖尿病的药物或药物组合物。
[0022] 较佳地，所述抗糖尿病药物为抗T2DM的药物。
[0023] 本发明的有益效果如下：
[0024] 本发明采用IR的T2DM型C57db/db小鼠为实验模型，发现野木瓜总皂苷具有较好 的抗T2DM活性，对防治糖尿病药物研究具有重要意义。
【附图说明】
[0025] 图1野木瓜总皂苷提取流程图。
[0026] 图2野木瓜总皂苷对各组小鼠FBG的影响（η= 6,mean土SD，###p< 0· 001与正 常组比较；***P< 0. 001与模型组比较）。
[0027] 图3各组小鼠061'1'实验结果（11 = 6，1116311±30，###?<0.001与正常组比较； *ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01，< 0· 001 与模型组比较）。
[0028] 图4各组小鼠ITT实验结果（η= 6,mean土SD) 〇
[0029] 图5血清中胰岛素的含量（η= 6,mean土SD，###p< 0· 001与正常组比较；***p < 0.001与模型组比较）。
[0030] 图6肝脏HE染色病理切片（A:正常对照组；B:T2DM;C:二甲双胍；D:总皂 苷（30mg/kg) ;E:总阜苷（60mg/kg) ;F:总阜苷（120mg/kg) ;(X200，图中标尺长度为 50μm))〇
[0031] 图7Westernblot检测肝脏组织IRS-1/PI3K/AKT蛋白表达的影响（η= 3,mean土SD，###ρ〈0· 001与正常组比较；*ρ〈0· 05, *林ρ〈0· 001与模型组比较）。
[0032] 图8Westernblot检测肝脏组织p-ΑΜΡΚ和p-ACC蛋白表达的影响（η= 3,mean土SD，#ρ〈0· 05与正常组比较；*ρ〈0· 05, *林ρ〈0· 001与模型组比较）。
[0033] 图9Westernblot检测骨豁肌组织GLUT-4蛋白表达的影响（η= 3,mean土SD， ##ρ〈0· 01与正常组比较；*ρ〈0· 05, *#ρ〈(λ001与模型组比较）。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以 更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0035] 如图1，本发明的野木瓜总皂苷的制备方法，包括如下步骤：
[0036] (1)取野木瓜藤茎粉末以体积浓度60 %的乙醇水溶液浸泡提取，浸泡3次，每次浸 泡时间为24小时，合并浸泡提取液，旋转蒸发干燥得到醇提物浸膏。
[0037] (2)步骤（1)得到的醇提物浸膏以体积浓度10 %的甲醇水溶液加热溶解后（加热 温度不高于75°C)，以乙酸乙酯萃取，分别收集上层乙酸乙酯萃取液和下层水相部分；
[0038] (3)步骤（2)的下层水相部分以正丁醇萃取，分别收集上层正丁醇萃取液和下层 水相部分，正丁醇萃取液蒸干后即得粗总皂苷；
[0039] (4)以大孔树脂纯化步骤（3)得到的粗总皂苷，包括如下步骤：
[0040] a.采用HP20大孔树脂柱，物料比（野木瓜粗总皂苷与树脂的质量比）1:10 ;
[0041] b.以水溶解野木瓜粗总皂苷，湿法上样；
[0042] c.依次以用5倍柱体积的水、体积浓度为30%的乙醇水溶液、体积浓度为50%的 乙醇水溶液、体积浓度为70%的乙醇水溶液和无水乙醇依次对HP20大孔树脂柱进行洗脱， 将每部分洗脱液合并后检查皂苷含量，将皂苷含量达到90 %以上的50 %乙醇和70 %乙醇 洗脱部分合并，通过薄层色谱分析法，将5个洗脱部分归类合并划分为7个部分。将7个部 分旋干后分别检测皂苷含量。
[0043] 含量测定：以香草醛-冰乙酸-高氯酸显色的分光光度的方法检测皂苷的含量。 参考文献：杨芳.野木瓜化学成分的研究.中南民族大学硕士学位论文.武汉：中南民族大 学，2011。结果显示50 %与70 %乙醇合并部分的皂苷含量最高，达到90. 48%，因此选用此 部位浓缩旋干的样品作为野木瓜总皂苷。
[0044] 实施例1急性毒理实验
[0045] 选取18~22g昆明小鼠雌雄各25只，分别随机分为正常组、2g/kg组、1. 5g/kg组、 lg/kg组、0. 5g/kg组，禁食不进水12h。用生理盐水将野木瓜总皂苷制成相应的浓度的混悬 液，按体重分别经口灌胃给药，正常组按体重经口灌胃给予相应剂量的生理盐水。24h后观 察各组小鼠生命体征。
[0046] 各个剂量总皂苷灌胃给药后，均未见任何死亡毒性。且小鼠进水进食正常，毛发有 光泽，动作敏捷，无任何毒副反应。
[0047] 实施例2T2DM型C57db/db动物分组和给药
[0048] T2DM型C57db/db雄性小鼠和普通型C57雄性小鼠进行适应性饲养2weeks后随机 分组，将T2DM型C57db/db雄性小鼠随机分为模型组、二甲双胍200mg/kg组、总皂苷低浓度 组（30mg/kg组）、总皂苷中浓度组（60mg/kg组）、总皂苷高浓度组（120mg/kg组），普通型 C57雄性小鼠为正常组，二甲双胍组为阳性药对照组，每组10只。按体重经口灌胃给药，每 三天称一次体重。
[0049] 如表1所示，模型组小鼠的体重与Day0比较增加了 12. 75%，而二甲双胍组小鼠 体重只增加了 9. 82%，总皂苷作用于T2DM型C57db/db小鼠后，高剂量组（120mg/kg组）的 体重只增加了 3. 67%，中剂量组（60mg/kg组）与低剂量组（30mg/kg组）的体重分别增加 了 7. 66%和3. 10%。总皂苷能明显控制T2DM型C57db/db小鼠体重。
[0050] 表 1
[0051]
[0052] η= 6,mean土SD
[0053] 实施例 3 空腹血糖（Fastingblood-glucose,FBG)的测定
[0054] 全体小鼠禁食不进水，过夜后测定FBG。具体操作为：用小手术剪剪去少许小鼠尾 部，挤出第一滴血后擦弃后挤出适量血液于血糖试纸上，用血糖仪测定血液中血糖含量。第 一天给药前所测得的空腹血糖记为初始血糖值，以7天为给药周期，每周期测一次FBG。
[0055] 结果如图2可见，T2DM型C57db/db小鼠血糖从Day0 (出生第8week)开始，FBG 持续升高，二甲双胍以200mg/kg的剂量灌胃给药持续一周后Day7天测FBG发现，能明显 降低其FBG，而总阜苷分别以120mg/kg、60mg/kg和30mg/kg三个剂量灌胃给药持续一周后 亦能明显降低其FBG，高剂量组（200mg/kg)的降糖效果与二甲双胍（200mg/kg)相当。当灌 胃给药持续2周后Dayl4天测FBG，结果显示，所有组小鼠空腹血糖均有升高趋势，但二甲双 胍与总阜苷给药组均能降低其FBG，且与模型组比较有显著性差异