树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肿瘤疫苗，特别是一种针对癌干细胞的树突状细胞肿瘤疫苗。
【背景技术】
[0002]常规的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射线治疗及化疗等。肿瘤疫苗为上述治疗方法以外的另一种治疗肿瘤的方法，是透过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。
[0003]树突状细胞(dendritic cell)是公认最能表达抗原的细胞,会将抗原分解后呈现给可以发挥免疫效应和杀伤功能的T细胞，令免疫系统产生反应。树突状细胞肿瘤疫苗是携带肿瘤抗原信息的功能性树突状细胞，能激活专一性T细胞产生免疫反应，发挥抗肿瘤效应和免疫记忆功能。
[0004]现有技术中的树突状细胞肿瘤疫苗，都是以肿瘤细胞为标靶，即透过裂解肿瘤细胞所得到的抗原，并将该抗原负载到患者的树突状细胞上，但如此得到的树突状细胞肿瘤疫苗用于治疗癌症，往往不能解决肿瘤复发的问题，主要原因是未将肿瘤中的癌干细胞全部杀死，而造成癌组织死灰复燃的生长，甚至经由极少数的癌干细胞驱动肿瘤的形成。
【发明内容】
[0005]本发明的一方面涉及一种树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，包含下列步骤:(a)对一肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤细胞；(b)以流式细胞仪自肿瘤细胞筛选具有特定细胞表面抗原的癌干细胞；(c)将步骤(b)所得到的癌干细胞照射放射线；(d)分离树突状细胞；(e)将树突状细胞与(c)步骤所得的癌干细胞共同培养，得到混合树突状细胞和癌干细胞的树突状细胞肿瘤疫苗。
[0006]根据本发明的一实施例，其中肿瘤组织为神经胶质瘤。
[0007]根据本发明的另一实施例，其中癌干细胞为神经胶质瘤干细胞。
[0008]根据本发明的再一实施例，其中特定细胞表面抗原为⑶133及⑶15。
[0009]根据本发明的又一实施例，其中放射线剂量为lOOGy。
[0010]本发明的另一方面涉及一种树突状细胞肿瘤疫苗，为一树突状细胞和一癌干细胞混合而得。
[0011]根据本发明的一实施例，其中树突状细胞为自体树突状细胞。
[0012]根据本发明的另一实施例，其中癌干细胞为自体癌干细胞。
[0013]根据本发明的另一实施例，其中癌干细胞为CD133阳性细胞，特别是神经胶质瘤干细胞。
[0014]藉此，本发明的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法可用于各种离体肿瘤组织进行树突状细胞肿瘤疫苗的制备，特别是神经胶质瘤，而所制得的树突状细胞肿瘤疫苗不仅具有毒杀肿瘤细胞的能力，更对于癌干细胞具有特异性的毒杀作用，以解决以肿瘤细胞为标靶的肿瘤疫苗仍存在化学治疗和放射性治疗后肿瘤耐受性提高，而复发率高和转移率高的问题。且本发明的树突状细胞肿瘤疫苗因为自体癌干细胞和自体树突状细胞，对于日后治疗的免疫排斥性低，免疫的全面性和特异性也更好。
[0015]上述
【发明内容】
旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此
【发明内容】
并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
【附图说明】
[0016]为使本发明知上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，对【附图说明】如下:
[0017]图1为神经胶质瘤干细胞的单层细胞培养及神经球培养的显微照片图。
[0018]图2A为比较例的树突状细胞肿瘤疫苗对于CD133阴性神经胶质瘤细胞毒杀作用的流式细胞仪结果图。
[0019]图2B为比较例的树突状细胞肿瘤疫苗对于⑶133阳性神经胶质瘤细胞毒杀作用的流式细胞仪结果图。
[0020]图3为比较例和本发明的树突状细胞肿瘤疫苗对于神经胶质瘤干细胞毒杀作用的显微照片图。
[0021]图4为本发明的树突状细胞肿瘤疫苗对神经胶质瘤干细胞毒杀作用的显微照片图。
[0022]图5为本发明的树突状细胞肿瘤疫苗对神经胶质瘤干细胞毒杀作用的量化图。
【具体实施方式】
[0023]本说明书揭露内容提出一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法，其自肿瘤组织分离肿瘤细胞，并进一步筛选癌干细胞，再将癌干细胞照射放射线后，与分离好的树突状细胞共同培养，得到混合树突状细胞和癌干细胞的树突状细胞肿瘤疫苗。
[0024]本发明前述所称的「癌干细胞(cancer stem cells, CSCs)」是肿瘤组织中存在极少量且具有自我更新能力(self-renewal)和分化潜能(differentiat1n potency)的细胞，癌干细胞并具备放射线抗性(rad1resistance)和化学抗性(chemoresistance),为肿瘤在接受放射线治疗或化学治疗后，呈现阻抗性的临床现象，是造成癌症病患对于治疗产生抗性、肿瘤容易复发，以及转移的重要关键。
[0025]本发明前述所称的「多形性胶质母细胞瘤(gl1blastoma multiforme, GBM)」是神经胶质瘤(gl1ma)中的恶性星状细胞瘤，为恶性脑肿瘤中最严重的一种。传统治疗多形性胶质母细胞瘤的方法为手术、放射疗法和化疗，但因多形性胶质母细胞瘤的浸润性非常高，所谓「浸润性」是因大脑中的胶质细胞为神经系统中的组成单位之一，提供支持、供给营养、维持环境恒定及提供绝缘等功能，故神经胶质细胞会紧紧包覆住神经轴突，由于轴突很长，如果神经胶质细胞发生癌变，癌细胞会顺着轴突蔓延至远方。因手术无法切除癌细胞遥远浸润部分，所以术后容易造成残瘤，术后需再辅以化学及放射治疗，但又因存在具放射线抗性和化学抗性的癌干细胞，治疗后复发率相当高。
[0026]本发明前述所称的「CD133」是一个具有5个跨膜区域的糖蛋白，首次于成体血液、骨髓与胚胎干细胞中分离出的CD34阳性前体细胞中被辨识，而被视为造血干细胞的标志，而后CD133更被认为是血癌、脑癌、视网膜母细胞瘤、肾脏癌、胰脏癌、前列腺癌、肝癌、髓母细胞瘤以及神经胶质瘤的癌干细胞的细胞表面标志。CD133阳性的增生和自我更新能力更胜于一般的肿瘤细胞，且具有致肿瘤性(tumorigenicity)与球体形成(sphereformat1n)等癌干细胞的特性。
[0027]下文提出多个试验例来说明本发明的某些方面，用以有利于本发明所属技术领域中普通技术人员，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制。
[0028]试验例1:神经胶质瘤干细胞的分离与培养
[0029]收集多形性胶质母细胞瘤组织，先以生理食盐水清洗并将其剪碎，再以木瓜蛋白酶分解系统(Worthington B1chemical)试剂盒将细胞打散。将已打散的多形性胶质母细胞瘤细胞以干细胞培养液[添加B27补充液、10ng/mL表皮生长因子Epidermalgrowth factor, EGF)和 lOng/mL 喊性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor, bFGF)的神经细胞培养基(Neurobasal_A medium)]再悬浮至少6小时，使多形性胶质母细胞瘤细胞再表达细胞表面抗原。加入接有PE或APC的⑶133和⑶15抗体(MiltenylB1tec.1nc.)于上述已打散的多形性胶质母细胞瘤细胞中，以标定⑶133和⑶15细胞表面抗原，并以流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorting, FACS)或磁珠来筛选同时具有CD133和CD15细胞表面抗原的细胞，此即为神经胶质瘤干细胞。将筛选出的神经胶质瘤干细胞培养于干细胞培养液中，并置于37°C含5% C02培养箱内。
[0030]试验例2:神经胶质瘤干细胞的鉴定
[0031]本试验例以体外和体内试验进一步得确认所筛选到的细胞为神经胶质瘤干细胞。于体外试验，以限制稀释法(limiting dilut1n assay)、基因表达分析及Western印迹法分析细胞特性。于体内试验，将所筛选到的细胞经由皮下注射(subcutaneous inject1n)和将细胞注入原发位置(orthotopic inject1n)来鉴定筛选到的细胞的致肿瘤性。
[0032]试验例2-1:限制稀释法
[0033]将神经胶质瘤干细胞进行神经球培养，先将3 X 106的活细胞接种于6公分细胞培养皿，再将球形细胞分离并稀释后接种于96孔盘中，每个孔含有0.2mL干细胞培养液，而细胞的稀释范围为200至1细胞/孔，之后每2天会再加入0.025mL的干细胞培养液于每个孔中直到第7天，并计算每1孔形成至少1个神经球所需的细胞数量。该分析法于神经胶质瘤干细胞分离的第0天时即测试，以确认所筛选到的细胞是否具有癌干细胞特性。
[0034]参照图1，为神经胶质瘤干细胞的单层细胞培养及神经球培养的显微照片图，可见神经胶质瘤细胞培养于含有胎牛血清的培养液中，细胞贴附于细胞培养皿上，且细胞型态为向外伸展，当照射放射线时，神经胶质瘤干细胞开始聚集，而神经胶质瘤细胞的型态未改变，细胞与细胞的间仍保有距离。而以干细胞培养液培养神经胶质瘤细胞时，神经胶质瘤细胞仍贴附于细胞培养皿上，但神经胶质瘤干细胞则形成球状，当