植入物和通过负压下使组织去细胞化来制造植入物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种植入物和制造植入物的方法。本发明尤其适用于制造源自如气 管、肌腫W及骨骼的软骨或巧化组织的植入物。
【背景技术】
[0002] 包含生物源支架的植入物已成为各种不同疾病和病状的治疗中组织/器官修复 和再生的重要选择。持续并且主要的障碍是需要从组织去除抗原呈递细胞材料，所述组织 接着成为支架。具体来说，当将相对致密的间质组织、结缔组织或支持组织，包括软骨组织， 如气管组织去细胞化时，如果有可能的话，极难从组织去除基本上所有的抗原呈递细胞。
[0003] 间质组织、结缔组织W及支持组织损伤，包括长气管病变，其对外科医生仍是挑 战。举例来说，由先天性缺陷、损害超过4. 5cm到6cm或超过30%的儿童总气管长度的外伤 或肿瘤产生的损伤不可经由一期缝合治疗。因此，很少将运些患者视为可W手术方式治愈 并且使用源自气管组织的植入物为所需替代方案。气管管道重建将扩大手术使用范围并且 改善生活质量。
[0004] 再生医学领域的最新进展尤其在关于组织工程改造的更换气管支架上大有前途。 理想更换应尽可能接近天然结构，从而提供稳定性和非免疫原性特征。为满足运些准则，大 量研究资源指向针对使用生物材料作为起始点。使用同种异体或异种材料制备用于再生目 的的支架需要将其所有的抗原性完全去除，同时保留细胞外基质W能够支持细胞连接并且 为空气通风提供足够刚性。
[0005] 已知去细胞化技术使用不同化学和生物试剂W洗掉抗原呈递细胞和细胞粒子。使 气管组织去细胞化的一个现有方案为基于清洁剂-酶促法，其中通过用各种清洁剂、酶W 及其它试剂灌注而从气管组织去除细胞。尽管出于同情在少数病例中提供已成功移植合适 的支架，但尚未达到标准临床实践。一个原因是花费约3周的冗长支架制备和由时间延迟 所导致的对患者的并发风险。
[0006] 用于临床使用的标准化"现成"支架不仅需要适当结构、功能W及生物力学特征， 而且需要在适合时间范围准备好的可行性。为改善组织的去细胞化，可利用不同方法，涵盖 酶和清洁剂的不同组合。因为已知运些试剂大部分会改变细胞外基质，所W仍所需已知技 术的不同方法W减缓或防止细胞外基质改变。
[0007] 因为间质组织、结缔组织W及支持组织，如软骨为特别致密的组织，所W需要一种 方法在相对较短的时间内将去细胞化药剂深度传递到组织中，并且不会影响细胞外基质的 组织超微结构，在制备气管植入物时尤其如此。
[0008] 因此本发明提供一种制造用于组织/器官修复的植入物的改进方法，尤其基于间 质组织、结缔组织或支持组织，包括软骨组织，如气管。其中植入物可W在相对较短的时段 内制成，同时维持基本上完整的细胞外基质并且去除基本上所有的抗原呈递细胞。
【发明内容】
[0009] 根据本发明的第一方面，提供一种从组织制造植入物的方法，所述方法包括至 少一个在负压下用至少一种去细胞化介质灌注所述组织的步骤，所述负压施加基本上 (substantially)整个灌注时段。
[0010] 根据本发明的第二方面，提供一种从间质组织、结缔组织或支持组织制造植入物 的方法，所述方法包含在负压下用至少一种去细胞化介质灌注所述组织的步骤，所述负压 施加基本上整个灌注时段。
[0011] 适合的间质组织、结缔组织或支持组织包括软骨、纤维软骨W及巧化软骨组织，如 气管、喉W及软骨本身、骨骼、肌腫、初带、骨骼-肌腫、骨骼-初带、神经组织、大血管（如动 脉和静脉）W及滑膜。
[0012] 可用于本发明方法的非间质组织、结缔组织或支持组织包括大脑、食管、肠（小肠 和大肠）、膜腺、脾、肝、肺、肾、淋己管、小血管。
[0013] "负压"包括低于环境的压力或部分或基本上完全真空。
[0014] 所得支架为组织的修复和再生提供极佳植入物。
[0015] 去细胞化过程除了去细胞化介质灌注步骤W外还可W包含一个或多个洗涂步骤。 优选地，所述或每一洗涂步骤也在负压下进行基本上整个所述或每一洗涂步骤时段。
[0016] 在一些【具体实施方式】中，基本上整个植入物制造方法在负压下进行。
[0017] 去细胞化介质经选择W便从组织中消耗细胞和细胞组分，同时使对细胞外基质 (extracellularmatrix;ECM)蛋白的损伤降到最低，从而获得ECM结构和功能尽可能得W 保留的支架。
[0018] 合适的去细胞化介质包括清洁剂，如十二烷基硫酸钢（sodiumdode巧1 sulphate;SDS)、去氧胆酸钢（sodiumdeoxycholate;S0C);包含亲水性聚氧乙締氧化物和 疏水性控部分的清洁剂，如化itonX-IOO(RTM);酶，如蛋白水解酶（例如膜蛋白酶）和核 酸酶（例如脱氧核糖核酸酶，如DNA酶I，和核糖核酸酶，如RNA酶）W及其组合。在一个或 多个去细胞化介质中还可W包括正憐酸Ξ下醋（T;risbut5d-n-phosphate;ranF〇。TBnP为 破坏蛋白质-蛋白质相互作用的洛剂。
[0019] 所述方法优选地包含用一种W上去细胞化介质灌注组织。适当地，所述方法包含 用至少一种清洁剂和至少一种核酸酶灌注组织。在一些【具体实施方式】中，所述方法包含用 清洁剂灌注组织和用核酸酶灌注组织的单独的步骤，并且清洁剂灌注步骤可W在核酸酶灌 注步骤之前进行。在一些【具体实施方式】中，每一清洁剂灌注步骤在负压下进行，而在一些其 他【具体实施方式】中，清洁剂灌注与核酸酶灌注步骤皆在负压下进行。
[0020] 每一灌注步骤可W在15°C与45°C之间或30°C与40°C之间的溫度下进行。在一些
【具体实施方式】中，灌注步骤在约37Γ下进行，在灌注步骤包括核酸酶物质时运样尤其有利。 当灌注步骤为清洁剂灌注步骤时，其可W在15°C与40°C之间的溫度，如约环境或室溫下进 行。
[0021] 在一些【具体实施方式】中，所述方法可W包含在每一灌注步骤之间的洗涂步骤。举 例来说，洗涂步骤可W使用任何适合的洗涂介质，如憐酸盐缓冲生理食盐水（phosphate bufferedsaline;PBS)、汉克斯平衡盐溶液或无菌水。洗涂步骤可W在rC与8°C之间或 2°C与6°C之间的溫度下进行。或者，所述或每一洗涂步骤可W在15°C与40°C之间的溫度， 如约37°C，或约环境或室溫下进行。在灌注步骤之间进行的每一洗涂步骤可W在负压下进 行，并且在一些【具体实施方式】中，所有洗涂步骤均在负压下进行。洗涂步骤可w包含在洗涂 介质上培育所述组织。
[0022] 灌注和/或洗涂可W在抗生素和/或抗霉菌素存在下进行。
[0023] 所述方法可W包含通过一系列步骤灌注组织，所述步骤包含：至少两个用核酸酶 灌注的步骤，随后至少一个用清洁剂或清洁剂混合物灌注的步骤，在每一步骤之间用洗涂 介质洗涂。在一些【具体实施方式】中，一系列的步骤包含两个用脱氧核糖核酸酶和核糖核 酸酶的混合物灌注的步骤，随后用离子型和非离子型清洁剂的混合物灌注，在每一步骤之 间用生理盐水溶液洗涂。在优选的【具体实施方式】中，清洁剂的混合物包含去氧胆酸钢和 TritonX-100 (RTM)，脱氧核糖核酸酶为DNA酶I，并且核糖核酸酶为RNA酶。
[0024] 适当地，进行每一灌注步骤在1小时与96小时之间，更优选地在18小时与84小 时之间，并且最优选地在24小时与72小时之间。当灌注步骤包含清洁剂物质的灌注时，所 述步骤至少可W进行12小时、18小时或24小时。当灌注步骤包含核酸酶的灌注时，所述步 骤至少可W进行1小时、18小时或24小时。 阳0巧]适当地，每一洗涂步骤可W进行在15分钟与96小时之间，如在12小时与96小时 之间，更优选地在18小时与72小时之间，或在24小时与72小时之间。在每一灌注步骤之 间或之后可W存在多个洗涂步骤，并且多个洗涂步骤中的每一者可W独立地进行在15分 钟与96小时之间。
[00%] 所述方法可W包含将去细胞化组织存储在适合介质中，如生理盐水溶液中。生理 盐水溶液可W包含至少一种抗生素和/或抗霉菌素物质。生理盐水溶液可W包含憐酸盐缓 冲生理盐水（PB巧溶液或汉克斯平衡盐溶液（可选地具有酸性化和/或Mg)并且可W包 含抗生素与抗霉菌素物质。优选地存储于rC与6°C之间，如约4°C的溫度下。
[0027] 一个或多个灌注步骤在负压下进行。对于包含间质组织、结缔组织或支持组织的 方法，在环境溫度下所述压力优选地不超过104?日、51^^、21^^、化?日或0.51^^。在一些具 体实施方式中，所述压力不超过IkPa、不超过0. 2kPa或不超过0.IkPa。人们认为，与原本 不使用负压将会发生的情况相比，在此类减压下用去细胞化剂灌注组织不仅提高组织吸收 灌注溶液和去细胞化介质的速度，而且能够使去细胞化介质更深地渗透到组织中，因此确 保所有组织均用介质灌注，W能够基本上在相对较短时段内完全去细胞化。此外，当洗涂步 骤在负压下进行时，去细胞化效应得W维持并加强。对于设及除了间质组织、结缔组织或支 持组织外的组织（例如食管、肠、肝、膜腺、肾、脾、肺W及小血管）的方法，所述压力可W不 超过 80kPa、70kPa、60kPa、50kPa、40kPa、30kPa、20kPa、lOkPa、5kPa、2kPa或IkPa。一般来 说，用于非间质组织、结缔组织或支持组织的压力高于用于间质组织、结缔组织或支持组织 的压力。