小肠黏膜下层载药补片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学工程中药物释放系统技术领域，具体涉及一种小肠黏膜下层载药补片及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]我国每年约有350万人因不同原因出现骨缺损，骨手术移植约为150万例，对替代骨的需求量非常大，尤其是大骨骼损伤的替代骨。随着组织工程技术的快速发展，在体外构建具有成骨传导性和成骨诱导性的人造替代骨是解决这一需求的重要途径。骨架材料在组织工程骨构建中起着至关重要的作用。相比于其他合成材料，天然细胞外基质(ECM)材料由于其以下特点:1.优异的生物相容性;2.最接近于体内细胞生长微环境的三维结构;3.为细胞生命活动提供了各种活性分子，一直被认为是理想的组织工程材料。猪小肠黏膜下层(SIS)是目前研究最多的天然细胞外基质材料，已通过美国Π)Α批准，被广泛用来构建人造膀胱、人造尿道、人造食道、人造血管和人造皮肤等软组织。SIS材料骨架成分胶原蛋白(collagen)已经被广泛用来作为骨架材料和药物载体用于骨组织工程。SIS相比于胶原有两大优点:1.SIS是个天然的药物库，它保留了许多有利于骨再生的生物活性分子;2.SIS在取材上更加便利，成本也要远低于胶原。国内外用SIS材料作为骨组织工程骨架材料报道已有一些，但是有一个问题使之无法进一步推广使用:成骨诱导性的不足。通过在SIS上载入具有促进骨再生的药物，并使之能够实现缓慢释放，将可以弥补这一缺陷。如果能解决这个难题，SIS材料将成为理想的骨组织工程材料。
[0003]骨组织工程中所需要的促进骨再生的药物一直是一个研究热点，BMP-2蛋白虽然是目前广泛被认可和采用的最有效的成骨诱导因子，但是由于其非常昂贵，而采用BMP基因导入方法又存在一定的安全问题，因此它的临床使用还是受到成本和安全性的制约。此外，BMP-2和其他蛋白药物都存在稳定性差、在体内半衰期短的问题，相应对于药物释放体系的要求非常高。因此寻找低成本、稳定又可以高效诱导骨再生的小分子化合物来替代BMP是非常有意义的。目前治疗骨质疏松的药物主要通过抑制骨吸收来实现骨代谢的平衡，但是通过促进成骨细胞分化和骨再生的化合物非常少，非常有限的报道包括:他汀类药物、异黄酮衍生物、TAK-778和赛菊芋黄素衍生物等。随着现代分离技术的发展，从天然产物中提取各种化合物，难度和成本都要远远低于传统的化学合成。中药作为中华名族的瑰宝，记载了大量中草药对于各种疾病的治疗，其有效性也越来越得到世界范围内的认可。植物药淫羊藿一直以来被认为具有强筋健骨的作用，其主要活性成分淫羊藿苷在骨代谢中的功能和机制直到最近几年才开始被逐渐研究。Chen Ke-Ming等人首次发现大鼠骨髓间充质干细胞经过淫羊藿苷处理之后，细胞增殖加速，分化标志物ALP、0CN和矿物化都有增加，表明淫羊藿苷可能具有促进骨代谢的作用。我们的研究发现淫羊藿苷可以通过上调Runx2表达和激活BMP信号通路来促进成骨细胞的分化;Hsieh等人也发现淫羊藿苷通过激活BMP和N0信号通路来促进成骨细胞分化，同时BMP-2、Smad4、Runx2和0PG等基因表达上调。Chung等的研究发现淫羊藿苷可以激活内皮细胞中的MEK/ERK和PI 3K/Akt/eN0S信号通路来加速血管生成;在小鼠临界骨损伤模型研究中，我们发现淫羊藿苷-磷酸钙水泥复合材料能够在6周之后诱导小鼠体内头盖骨损伤处形成具有血管的新生骨。淫羊藿苷是一种非常具有潜力的可以用于骨组织工程的药物。但是目前尚未有在SIS上载入淫羊藿苷作为促进骨再生的缓释药物的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种具有极强的促骨再生能力的小肠黏膜下层载药补片。
[0005]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种可操作性强的小肠黏膜下层载药补片的制备方法。
[0006]本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种小肠黏膜下层载药补片的应用。
[0007]本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为:小肠黏膜下层载药补片，该载药补片的微观结构包括SIS胶原纤维骨架和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷，所述的SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构，所述的淫羊藿苷为颗粒状，所述的淫羊藿苷附着于所述的SIS胶原纤维骨架上，所述的淫羊藿苷的附着量为20?80yg/cm2。
[0008]本发明小肠黏膜下层载药补片，在SIS胶原纤维骨架上附着颗粒状的淫羊藿苷，建立稳定的药物释放体系，将SIS胶原纤维骨架和淫羊藿苷这两个极具潜力的骨组织工程元素结合起来，形成的小肠黏膜下层载药补片复合材料可靠、稳定，对淫羊藿苷安全、经济、化学性质稳定及优异的促骨再生能力和促血管再生能力等特性加以充分利用，该小肠黏膜下层载药补片具有极强的促骨再生能力，在骨再生领域具有广泛的应用前景。
[0009]本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为:一种小肠黏膜下层载药补片的制备方法，包括以下步骤:
[0010]1)小肠黏膜下层补片的准备:在无菌环境下，取出干燥无菌的SIS材料，裁剪成所需尺寸的小肠黏膜下层补片，再将裁剪好的小肠黏膜下层补片用去离子水浸润12?24h使材料充分润湿，弃去去离子水后用50%的乙醇溶液浸润1?2h，弃去乙醇溶液后依次换用70%、80%、90%的乙醇溶液和无水乙醇浸润补片1?2h，最后将小肠黏膜下层补片置于无水乙醇中待用；
[0011 ] 2)淫羊藿苷工作溶液的配制:在无菌环境下，将粉状淫羊藿苷加入至二甲亚砜中，混匀震荡溶解，制得浓度为50mg/mL的淫羊藿苷储备液;取lmL的淫羊藿苷储备液，与无水乙醇混合，制得终浓度为0.5?2.5mg/mL的淫羊藿苷工作溶液；
[0012]3)小肠黏膜下层载药补片的制备:在无菌环境下，从无水乙醇中取出小肠黏膜下层补片，按照400yL/Cm2的用量将淫羊藿苷工作溶液分几次均匀加载至小肠黏膜下层补片上，每次加载量为lOOyL，两次加载的时间间隔为30?50分钟，直至所有淫羊藿苷工作溶液全部加载至小肠黏膜下层补片上，得到小肠黏膜下层载药补片;将得到的载药补片置于通风室温条件24?48h，随后将载药补片放入去离子水中并在室温下摇晃24?48h，弃去去离子水后将载药补片放入PBS缓冲液中，室温下震荡摇晃，每24h弃去旧的PBS缓冲液并加入等量新的PBS缓冲液，连续5天后将载药补片取出并放入新的PBS缓冲液中，于2?6°C保存备用。
[0013]步骤3)中，淫羊藿苷工作溶液加载至小肠黏膜下层补片的方式包括滴加、喷淋、注射和浸泡中的至少一种。
[0014]本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为:上述小肠黏膜下层载药补片在骨再生中的应用。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明小肠黏膜下层载药补片，在SIS胶原纤维骨架上附着颗粒状的淫羊藿苷，建立稳定的药物释放体系，将SIS胶原纤维骨架和淫羊藿苷这两个极具潜力的骨组织工程元素结合起来，形成的小肠黏膜下层载药补片复合材料可靠、稳定，对淫羊藿苷安全、经济、化学性质稳定及优异的促骨再生能力和促血管再生能力等特性加以充分利用，该小肠黏膜下层载药补片具有极强的促骨再生能力，制备方法简单，在骨再生领域具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0016]图1为未加载药物的SIS胶原纤维骨架的SEM图片；
[0017]图2为实施例一的载药补片的SEM图片；
[0018]图3为本发明小肠黏膜下层载药补片的结构示意图；
[0019]图4为实施例一的载药补片的淫羊藿苷释放曲线；
[0020]图5为实施例一的载药补片体外生物学活性验证结果；
[0021]图6为无植入物的空白对照骨的HE染色结果；
[0022]图7为实施例一的载药补片组的HE染色结果。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0024]实施例一的小肠黏膜下层载药补片，其微观结构包括SIS胶原纤维骨架和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷，SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构，淫羊藿苷为颗粒状(颗粒度为0.3?0.6μπι)，淫羊藿苷附着于SIS胶原纤维骨架上，淫羊藿苷的附着量为33.2±5.6yg/cm2，其制备方法包括以下步骤:
[0025 ] 1)小肠黏膜下层补片的准备:在无菌环境下，取出干燥无菌的SIS材料，裁剪成1 cmX lcm的小肠黏膜下层补片，再将裁剪好的小肠黏膜下层补片用去离子水浸润12?24h使材料充分润湿，弃去去离子水后用50 %的乙醇溶液浸润1?2h，弃去乙醇溶液后依次换用70%、80%、90%的乙醇溶液和无水乙醇浸润补片1?2h，最后将小肠黏膜下层补片置于无水乙醇中待用；
[0026]2)淫羊藿苷工作溶液的配制:在无菌环境下，将粉状淫羊藿苷加入至二甲亚砜中，混匀震荡溶解，制得浓度为50mg/mL的淫羊藿苷储备液;取lmL的淫羊藿苷储备液，与无水乙醇混合，制得终浓度为0.5mg/mL的淫羊藿苷工作溶液；
[0027]3)小肠黏膜下层载药补片的制备:在无菌环境下，从无水乙醇中取出小肠黏膜下层补片，将400yL的0.5mg/mL淫羊藿苷工作溶液分四次均匀加载至小肠黏膜下层补片上，每次加载量为100yL，两次加载的时间间隔为30?50分钟，直至400yL淫羊藿苷工作溶液全部加载至小肠黏膜下层补片上，得到实施例一的小肠黏膜下层载药补片;将得到的载药补片置于通风室温条件24?48h，随后将载药补片放入去离子水中并在室温下摇晃24?48h，弃去去离子水后将载药补片放入PBS缓冲液中，室温下震荡摇晃，每24h弃去旧的PBS缓冲液并加入等量新的PBS缓冲液，连续5天后将载药补片取出并放入新的PBS缓冲液中，于2?6°C保存备用。
[0028]实施例二的小肠黏膜下层载药补片，其微观结构包括SIS胶原纤维骨架和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷，SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构，淫羊藿苷为颗粒状(颗粒度为0.3?5μπι)，淫羊藿苷附着于SIS胶原纤维骨架上，淫羊藿苷的附着量为56.2±8.8μg/cm2，其制备方法包括以下步骤:
[0029 ] 1)小肠黏膜下层补片的准备:在无菌环境下，取出干燥无菌的SIS材料，裁剪成1 cmX lcm的小肠黏膜下层补片，再将裁剪好的小肠黏膜下层补片用去离子水浸润12?24h使材料充分润湿，弃去去离子水后用50 %的乙醇溶液浸润1?2h，弃去乙醇溶液后依次换用70%、80%、90%的乙醇溶液和无水乙醇浸润补片1?2h，最后将小肠黏膜下层补片置于无水乙醇中待用；
[0030]2)淫羊藿苷工作溶液的配制:在无菌环境下，将粉状淫羊藿苷加入至二甲亚砜中，混匀震荡溶解，制得浓度为50mg/mL的淫羊