一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药中的预防用动物疫苗领域，具体地，涉及一种新佐剂仔猪大 肠杆菌灭活疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下的一种典型的多因素性疾病，是目前最严重的 仔猪疾病群之一，也是引起仔猪死亡的重要原因，据调查，仔猪因腹泻死亡占仔猪死亡总数 的39.8%。30kg以下的仔猪，全年平均发病率46.5%，死亡率10.3%。仔猪腹泻在养猪业危 害中居首位，严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬率较低、仔猪成活率下降、生长 缓慢、生长发育停滞(即所谓的僵猪），甚至死亡。
[0003] 致病性大肠杆菌是仔猪致病菌之一。疫苗免疫是控制大肠杆菌病的主要方法。从 动物体分离或实验室保存鉴定的大肠杆菌菌株，经扩增培养，配制成适当浓度，用甲醛灭 活，使大肠杆菌失去毒力但又保持免疫原性，制成灭活疫苗。在疫苗中添加白油佐剂或氢氧 化铝胶剂，有利于增强疫苗的免疫效果。
[0004] 疫苗防治采用菌种培养-灭活后添加氢氧化铝制得的悬浮液体疫苗，这种免疫疫 苗添加的氢氧化铝使用后残留量大，不利于肉质类家禽使用，并且现有的疫苗存在免疫效 果不佳问题，需要提供一种增强免疫效果的疫苗来预防仔猪腹泻。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方 法，该方法通过将仔猪腹泻大肠杆菌鉴定后作为疫苗抗原菌株;将该疫苗菌株常规培养后， 然后收集细菌，用巴氏灭菌或甲醛灭菌，灭活培养的疫苗活菌，然后溶生理盐水或其他溶液 再调整灭活菌浓度，用紫外分〇D57Q测定在灭活的菌菌浓度在0.8-1.0范围内，每lml的菌液 抗原中加入0.5-lmg的基因工程霍乱毒素B亚单位佐剂到疫苗中配置成疫苗原液，最后在疫 苗原液中添加质量为疫苗原液质量的3-5%的甘露糖或甘露醇，用玻璃瓶等分装后冻干灭 活疫苗，可常温保存12-18个月或低温长期保存。该灭活疫苗经过4次免疫，能够有效的提高 血液和肠液抗体IgG/IgA的量，达到了既可口服免疫也可肌肉注射免疫，减少了疫苗肌肉注 射的免疫量，提高了免疫保护性。冻干疫苗实现了疫苗运输和保存对温度的过度依赖，免疫 选择方便。
[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
[0007] -种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)、制备大肠杆菌菌液抗原：将导致仔猪腹泻的大肠杆菌分离，常规培养鉴定合 格后经化学或巴氏灭活后，离心分离收集菌体，再用生理盐水洗涤后，稀释成io6-io1()cfu/ ml的菌液得菌液抗原；
[0009] (2)、制备疫苗原液:每lml的菌液抗原中加入0.5-lmg的疫苗佐剂混匀，所述疫苗 佐剂为基因工程表达的重组霍乱毒素B亚单位蛋白；
[0010] (3)、制备疫苗成品:在疫苗原液中加入质量为疫苗原液质量的3-5%甘露糖或甘 露醇，分装后冻干。
[0011] 需要强调的是，加入甘露醇的量和CTB的量需要配合才能起到免疫效果。
[0012] 步骤(2)中的重组霍乱毒素B亚单位蛋白的纯度不低于70%，蛋白浓度为l-10mg/ ml〇
[0013] 步骤（2)中的重组霍乱毒素Β亚单位的构建包括：1)、设计相应引物扩增该片段； 2):构建重组质粒pET28a( + )/CTB，将其转化宿主大肠杆菌并做PCR、双酶切和测序鉴定，筛 选出阳性克隆，表达产物经SDS-PAGE及Westernblot，分别测定其大小和特异性;3)、高效 表达rCTB，再将rCTB纯化;4)、真空冷冻干燥重组工程菌备用。rCTB即为重组霍乱毒素B亚单 位。
[0014] 步骤（1)中的离心转速为6000-8000rpm，离心时间10_15min。
[0015] 如上述的制备方法制得的疫苗，常规冻干后为白色疏松体，且加入蒸馏水3-8分钟 能完全溶解。
[0016] 如上所述的疫苗的应用方法为:按0、14、28、42天的肌肉注射或口服免疫总共4次。 每次免疫前将疫苗用蒸馏水复溶，肌肉注射免疫：每g动物体重4ul-40ul菌量为106-101()CFU/ml的疫苗；口服免疫:将l-10ml菌量为106-101()CFU/ml的疫苗搅拌至温度低于室温 的食品中喂食待免疫动物(每kg动物体重）。
[0017] 综上，本发明的有益效果是：
[0018] 1.本发明通过无数次实验对菌液浓度、菌液中添加的佐剂量以及甘露醇量进行合 理配比，能够保证疫苗在免疫过程中引发较好的免疫反应，而避免免疫耐受、成型不好或 者不良反应的问题出现。
[0019] 2.选择了基因工程的重组生物佐剂CTB，提高了免疫效果，保证了口服和肌肉注射 疫苗对仔猪腹泻菌的攻击保护性均100%。
[0020] 3.选择重组生物佐剂CTB和甘露糖作为添加剂，冻干后疫苗成粉末状，水分含量低 于3%，可在室温（10-30°C)保存18-36个月，降低了疫苗必须在2-10°C低温保存运输的苛刻 条件。
[0021] 4.疫苗可以肌肉注射也可以溶解后口服。口服免疫可对难以保定的动物减少了免 疫过程的难度，减少了人工，减少了因为打针等对动物惊扰等;从免疫次数看，无论是肌注 还是口服组免疫4次的抗体水平明显好于免疫1、2、3次的抗体水平。
[0022] 5.采用巴氏灭活法灭活细菌，杜绝了化学试剂在疫苗灭活中的应用，保证了此方 法制备的疫苗不含化学试剂。
【附图说明】
[0023] 图1为免疫不同时间血清抗体IgG的变化(肌注组）图；
[0024] 图2为免疫不同时间血清抗体IgG的变化（口服组）图；
[0025] 图3为免疫不同时间血清抗体IgA的变化(肌注组）图；
[0026] 图4为免疫不同时间血清抗体IgA的变化（口服组)图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于 此。
[0028] 实施例1
[0029] 大肠杆菌菌株：由西藏大学农牧学院动物科学学院高原动物疫病检测中心研究 团队分离、鉴定、筛选和保种。
[0030] 甘露醇2013103101，成都科龙化工；LB培养液：TryptonelOg，YeastExtract5g， NaCl10g，用ddH20定容至1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌，4°C存放。
[0031] LB培养基平板：Tryptone10g，YeastExtract5g，NaCl10g，琼脂20g，定容于 ddH20 1 000ml，调定pH至7.0，高压灭菌20min，酒精灯下，将溶化的LB培养基倒入已消毒备 用的平皿，冷却凝固后4°C存放备用。
[0032] 卡那霉素（储存液）：卡那霉素0.3g，定容于ddH2〇 10ml，0.22um滤器过滤除菌，分 装后于-20°C存放备用。
[0033]氯霉素(储存液）：氯霉素0.34g，定容于无水乙醇10ml，分装后于-20°C存放备用。 [0034] 疫苗制备
[0035] (1)将大肠杆菌接种在LB固体平板上，放于37°C恒温培养箱中，培养过夜。
[0036] (2)洗脱细菌，接种到1LLB液体培养基中，放于37°C恒温摇床中，培养24h。
[0037] (3)培养后进行巴氏灭活法或者其他方法(如化学等方法)灭活。
[0038] (4)灭活后，6000-8000r/min离心 10_15min，收集菌体。
[0039] (5)收集菌体后，用3-5%的甘露醇溶液重悬，重悬后一部分直接冻干，一部分加入 纯度不低于70%的疫苗佐剂冻干（纯度可以为75%、80%、88%、90%、95%等，浓度为1_ 10mg/ml)，制备成:仔猪大肠杆菌灭活苗和仔猪大肠杆菌灭活佐剂疫苗（白色疏松体，且加 入蒸馏水3-8分钟能完全溶解）。
[0040]重组霍乱毒素B亚单位蛋白的构建 [0041 ] 目的基因CTB的扩增 [0042]目的基因片段引物的设计 [0043]引物序列如下：
[0044] 上游引物：5 ' -gcggaattcaatattactgatttggtggc-3 '
[0045] 下游引物：5 ' -atcaagcttgatttgccatactaattgcgg-3 '
[0046]上、下游引物5'端分别设有EcoRI和Hindin酶切位点（下划线处），扩增产物长度 为300bp。
[0047] 目的基因片段的体外扩增
[0048] 以CTB基因为模板，用上述引物进行常规PCR扩增。
[0049] rCTB工程菌的构建
[0050] pET28a( + )/CTB重组质粒转化感受态细胞
[00511⑴_80°C取出感受态细胞(50μ1/管），冰上融化，加入5μ1待转化质粒 [0052] ⑵冰上，30min(间隔震荡）。-44°C，90s(勿震荡）。-冰上放置2min
[0053] (3)加入1^培养基20(^1，37°(3,200印111(温柔摇菌），501^11。
[0054]⑷离心去100μ1上清，取余下的菌液涂板(LB/kan+，氯霉素+)至液体完全被吸收， 倒置平皿，37°C培养14-18h，观察菌落。
[0055] CTB的表达及鉴定
[0056] pET28a( +)/CTB重组质粒的诱导表达
[0057]⑴挑取鉴定正确的阳性克隆菌落接种于LB液体培养基在终浓度为34yg/m