菌群恢复疗法（mrt）、组合物和制造方法
【专利说明】菌群恢复疗法(MRT)、组合物和制造方法 [0001] 相关申请的交叉引用
[0002]依照美国法典第35章第119条，本申请要求于2013年6月5日提交的美国临时专利 申请序列号61/831,409的优先权，该临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本公开是关于用于治疗消化道疾病和/或病症的组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 现已开发出了用于治疗消化道疾病和/或病症的多种组合物和方法。就已知的组 合物和方法而言，各自具有某些优点和缺点。对于提供用于治疗消化道疾病和/或病症的替 代组合物和方法存在着持续的需求。
【发明内容】
[0005] 本文中公开了菌群恢复治疗组合物和用于制造、加工和/或输送菌群恢复治疗组 合物的方法。用于制造菌群恢复治疗组合物的示例性方法可包括采集人粪便样品、和将稀 释剂添加到人粪便样品中而形成稀释样品。稀释剂可包含冷冻保护剂。该方法还可包括用 混合装置将稀释样品混合、和过滤稀释样品。过滤可形成滤液。该方法还可包括将滤液转移 到样品袋、和将样品袋密封。
[0006] -种用于制造、加工和包装菌群恢复治疗组合物的示例性方法可包括从预筛选的 供体中采集粪便样品、将粪便样品转移到过滤袋、和将稀释剂添加到过滤袋中。稀释剂可包 含冷冻保护剂。该方法还可包括:将过滤袋密封、将密封的过滤袋转移到混合器、和将滤液 从过滤袋转移到样品袋。将滤液从过滤袋转移到样品袋可将菌群恢复治疗组合物限制在样 品袋的内部。该方法还可包括将样品袋密封、使样品袋冷却、和将冷却的样品袋转移到温度 受控制的储存设备。将冷却的样品袋转移到温度受控制的储存设备可包括将菌群恢复治疗 组合物冷冻。该方法还可包括:将冷冻的菌群恢复治疗组合物解冻、将样品袋在隔热的包装 系统中包装、和将包装的样品袋运送到治疗设施。
[0007] -种用于医疗的示例性方法可包括:从预筛选的供体中采集粪便样品、将粪便样 品转移到过滤袋、和将稀释剂添加到过滤袋。稀释剂可包含冷冻保护剂。该方法还可包括： 将过滤袋密封、将密封的过滤袋转移到混合机、和将滤液从过滤袋转移到样品袋。将滤液从 过滤袋转移到样品袋可将菌群恢复治疗组合物限制在样品袋中。该方法还可包括:将样品 袋密封、使样品袋冷却、和将冷却的样品袋转移到温度受控制的储存设备。将冷却的样品袋 转移到控制温度的储存设备可包括将菌群恢复治疗组合物冷冻。该方法还可包括:将冷冻 的菌群恢复治疗组合物解冻、将样品袋在隔热的包装系统中包装、将包装的样品袋运送到 治疗设施、和将菌群恢复治疗组合物给药予患者。
[0008] 上面对一些实施方式的概述并非意图描述本公开的各公开实施方式或者每个实 施方案。下面的附图和详细说明更具体地举例说明了这些实施方式。
【附图说明】
[0009] 基于以下的详细说明并结合附图可更完全地理解本公开，在附图中：
[0010] 图1是示例性地描绘用于采集和检查供体粪便样品的过程的流程图；
[0011]图2是示意性地描绘用于筛选粪便供体的流程图；
[0012] 图3A和图3B是描绘用于制造菌群恢复治疗组合物的一个示例性方法的流程图；
[0013] 图4是描绘用于订购和运送菌群恢复治疗组合物的示例性过程的流程图；
[0014] 图5是描绘用于订购和运送菌群恢复治疗组合物的其他示例性过程的流程图；
[0015] 图6是一个示例性包装系统的示意图；
[0016] 图7示出了一个示例性的样品袋；
[0017] 图8示出了一个示例性的管组件。
[0018] 虽然本公开适合于各种修改和替代形态，但通过在附图中的举例而揭示了其细节 并且将详细地描述其细节。然而，应当理解的是，意图并非是将本发明局限于所描述的具体 实施方式。相反，本发明包括落在本公开精神和范围内的所有修改、等同物、和替代物。
【具体实施方式】
[0019] 就以下所定义的术语而言，应当采用这些定义，除非在权利要求中或者在本说明 书中的其他地方给出不同的定义。
[0020] 无论是否明确地指出，本文中的所有数值假定是由术语"大约"所修饰。术语"大 约"一般指代本领域技术人员将会认为等同于所列举值(例如，具有相同的功能或结果）的 数量范围。在许多情况下，术语"大约"可包括被四舍五入到最接近的有效数字的数量。
[0021 ]利用端点对数值范围的陈述包括在该范围内的所有数量(例如，1至5包括I、1.5、 2、2·75、3、3·80、4和5)。
[0022] 本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数所 指对象，除非上下文中明确地规定。本说明书和所附权利要求中所使用的术语"或者"通常 是以包括"和/或"的意义而使用，除非上下文中明确地指出。
[0023] 应注意的是，本说明书中对"一个实施方式"、"一些实施方式"、"其他实施方式"等 的引述表明所描述实施方式可包括1个以上的特定的特征、结构和/或特性。然而，这种陈述 不一定意味着所有实施方式包括该特定的特征、结构和/或特性。此外，当结合一个实施方 式来描述特定的特征、结构、和/或特性时，应当理解的是，无论是否明确地描述，这种特征、 结构和/或特性也可使用于其他实施方式，除非明确地指出相反的情况。
[0024] 应参照附图来阅读以下的详细说明，其中在不同的附图中对于类似的元件赋予相 同的编号。附图（不一定按比例绘制)描绘了说明性的实施方式而并非意图限制本发明的范 围。
[0025] 本文中使用的"哺乳动物"是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于:人类和非人灵 长类(如黑猩猩、及其他的猿和猴种）；家畜（如牛、绵羊、猪、山羊和马）；家养哺乳动物(如狗 和猫）；实验动物，包括啮齿类动物(如小鼠、大鼠和豚鼠），等。该术语并不指代特定的年龄 或性别。因此，成年人和新生儿受试者以及胎儿，无论是雄性或雌性，均意图被包括在该术 语的范围内。
[0026] 本文中使用的术语"冷冻保存"是指在低温下冷却和储存生物细胞、组织或器官以 维持它们的存活的过程。作为非限制性例，冷冻保存可以是在低于冻结点的温度下(例如，_ 20°C以下、_80°C以下，等)冷却和储存细胞的技术，该技术允许解冻时的细胞的高存活率。
[0027] 本文中使用的术语"冷冻保护剂"是指用于防止生物细胞或组织受到冷冻影响的 物质。
[0028] 本文中所使用的"菌群"可以指代人类微生物组、人类菌群、或人肠道菌群。人类微 生物菌落(或人类菌群)可被理解成是存在于皮肤表面上和皮肤的深层中、唾液和口腔黏膜 中、结膜中、和人胃肠道中的微生物的聚集体。人类微生物组是由细菌、真菌、病毒、和古细 菌所组成。这些生物体中的至少部分执行对人宿主有用的任务。在正常情况下，这些微生物 不导致人宿主的疾病，而是参与维持健康。因此，该种群的生物体常常被称为"正常菌群"。
[0029] 生存于人胃肠道中的微生物种群通常被称为"微生物菌群"、"肠道菌群"和/或"肠 道菌群"。人肠道的微生物菌群包括有助于消化、维生素合成、和形成并非由有人体所产生 酶的多种微生物。
[0030] 本文中所使用的词组"菌群恢复治疗剂"是指一种组合物，该组合物可包括但不限 于:取自患者或供体的含有活肠道菌群的人粪便材料、稀释剂、和冷冻保护剂。其他组合物 包括等效的经冷冻干燥并复原的粪便、或者"合成的"粪便组合物。在将其使用于菌群恢复 治疗之前，对人粪便材料进行筛检以确定是否存在病原微生物。对人粪便材料进行筛检以 确定以下病原微生物的存在：梭菌属（Clostridium species)(包括艰难梭菌 C.difficile)、诺如病毒Norovirus、腺病毒Adenovirus、肠道病原体entric pathogens、贾 第鞭毛虫属Giardia species、隐孢子虫属Cryptosporidia species的抗原、及其他病原体 (包括耐酸细菌acid-fast bactria、肠球菌enterococci，包括但不限于万古霉素耐药肠球 菌(VRE)、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA))、以及任何卵或寄生体、或者芽孢形成寄生 虫(包括但不限于等孢子球虫、圆孢球虫、和囊孢子虫）。
[0031] 有多于1000个不同属的细菌存在于健康的胃肠(GI)道中。梭菌是厌氧的产芽孢细 菌。某些属的梭菌是产生对人类会是有害的毒素的病原体。艰难梭菌（"C diff"）是如果在 胃肠道中种群过密则可以释放出会导致若干症状的毒素的梭菌的一个属，所述症状包括胃 气胀、便秘、腹泻、炎症、腹痛、在某些情况下会导致死亡的其他症状。
[0032] 当受到应激时，艰难梭菌形成可以耐受许多活性细菌所不能耐受的极端条件的芽 孢。通常，梭菌在健康的胃肠道中竞争较弱。然而，抗生素会扰乱正常的肠内菌群，从而导致 艰难梭菌的过度生长。在某些实例中，艰难梭菌芽孢对各种抗生素会是耐药。因此，当正常 肠内菌丛被清除时，艰难梭菌芽孢仍然存在，从而导致大的艰难梭菌群体。
[0033] 根据美国疾病控制与预防中心(CDC)，在美国每年报告了大约337，000例艰难梭菌 感染(CDI)，其中导致大约14,000例死亡。目前的标准治疗是抗生素治疗;通常使用甲硝唑 和/或万古霉素。在最初的抗微生物治疗之后，大约25%的患者经历症状的复发。在这个复 发性患者人群中，大约45-65%形成持续的复发性艰难梭菌感染。持续的复发性艰难梭菌感 染与高发病率和死亡率有关。例如，在美国每年艰难梭菌种群过密发生率据估计为150至 270万例发生，并且还在增加中。在一个估计中，从2001年到2005年由于艰难梭菌的退院数 加倍，并且据估计具有5 %至25 %的复合年增长率。目前的估计表明受艰难梭菌种群过密影 响的患者经历从3天到36天的延长的住院时间，其中将近20%的受影响患者在180天内重新 入院，各患者比未受影响的患者更有可能转到长期护理机构。据估计艰难梭菌的经济负担 是在每年10至30亿美元。此外，据估计每天300例患者死亡归因于艰难梭菌种群过密，死亡 率为1至7.7%，并且还在增加中。
[0034]艰难梭菌的传统治疗通常包括抗生素的应用。由于低价格和高疗效，甲硝唑 ("FlagyloT)是所选用的抗生素。然而，对于复发的病例（高达20%的总病例，例如对甲硝 唑耐药）、怀孕患者、或者年龄小于10岁的患者而言，通常使用万古霉素（"Vancocin?"）。 然而，万古霉素，尽管通常具有比甲硝唑更少的副作用，但具有高得多的成本并且会导致现 存的艰难梭菌对其他抗生素产生耐药性。
[0035]在第一次发生中，艰难梭菌的抗生素治疗可以在2至4天内以大约90%以上的比率 有效地快速地治疗腹泻。然而，艰难梭菌通常在第一次复发后(例如，抗生素中止使用的数 天至12周后）以估计的20%比率(例如，15%-30%)复发。然而，对于第一次复发后的各次复 发，复发率大大地增加到第二次复发后的估计的40%复发率，并且增加到其后的大于所估 计的60%以上的复发率。据估计，大约5%的患者具有6次以上的复发。
[0036] 各次发病之后艰难梭菌的治疗通常有变化。例如，对于第一次轻度至中度的复发， 可以口服给予甲硝唑(例如，以500mg的剂量，每日三次（"TID"）达10至14天）。对于第二次复 发，可以以逐步减小的剂量或脉冲式剂量口服给予万古霉素(例如，以125mg的剂量，每日四 次（"QID"）达14天；以125mg的剂量，每日两次（"BID"）达7天；以125mg的剂量，每日一次 ("QD"）达7天；以125mg的剂量，每2天一次达8天（四次给药）；以125mg的剂量，每3天一次达 15天(五次给药)等）。对于第三次复发，可以以更大的剂量应用万古霉素（例如，以125mg的 剂量，每天四次（"QID"）达14天），并与用于复发性感染的任何其他选择相结合，例如静脉注 射免疫球蛋白（例如，以400mg/kg体重的剂量，每三周一次，根据效果总共2或3次给药），或 者在万古霉素给药后使用利福霉素（例如，利福霉素，以400mg的剂量，每日两次（"BID"）达 14天)等。
[0037] 粪便移植(FT)(是一种与菌群恢复治疗(MRT)有关的治疗方法)已被用作对于一些 具有复发性艰难梭菌感染的患者的最后对策。在抗微生物治疗后，将粪便移植用于在患者 胃肠道菌群中重新建立健康微生物混合物。在超过480个已报告病例中，在治愈复发性艰难 梭菌感染中有约90%的累积成功率，并且没有归因于粪便移植材料的任何不良事件。目前 的惯例是从家庭成员或治疗机构内部的志愿者中获取粪便样品以便移植入患者。该治疗技 术的一个明显问题是粪便移植材料未经标准化。尽管所选择的供体通常在提供时被认为是 健康的，但这不足以同时保证被移植微生物的质量和存活率。可存在影响粪便材料的、对供 体是未知的疾病状态。除了粪便原材料的质量外，在接受或治疗机构中缺乏用于加工和处 理的标准化程序会导致在给予患者的粪便移植材料的质量和存活率方面的问题。此外，各 机构必须对粪便原材料进行处理，这并不方便。
[0038] 对于保证用于患者的菌群恢复治疗产品在给药时的质量和存活率的标准化的、经 预处理的菌群恢复治疗产品存在着需求。还期望具有也可以在以易于处理和可输送状态下 进行加工被运送至合适的治疗机构的菌群恢复治疗(MRT)产品，以避免在各机构对粪便原 材料进行处理。由于这些改进，菌群恢复治疗可以变为一种理想的/可行的用于艰难梭菌感 染(CDI)的主要治疗选择，而不是在少量机构处的最后治疗对策。
[0039] 此外，本专利文件描述了 ：接收取自多位供体的多个供体粪便样品、并且利用各供 体粪便样品的至少一个特性来储存和检索各个供体粪便样品。在一个实例中，可以对供体 粪便样品进行筛选和加工以便随后用于粪便细菌疗法，从而用健康或期望的肠道菌群来代 替患者消化道中的致病性或不受欢迎的生物。
[0040] 本公开提供了一种菌群恢复治疗组合物，该组合物包含有效量的粪便菌群与有效 量的冷冻保护剂的混合物。一个示例性的冷冻保护剂可包含聚乙二醇。此外，在本公开的菌 群恢复治疗组合物中，聚乙二醇是以大约5_60g/ml、或者大约5-30g/ml、或者小于大约30g/ ml的浓度而存在。该组合物还可以包含生理盐水作为稀释剂。本公开的组合物可包含具有 在大约600至大约20000范围内的平均分子量的聚乙二醇。例如，可以使用具有3150的平均 分子量的PEG-3150。在某些实施方式中，菌群恢复治疗组合物包括来源于1个以上的人粪便 样品的粪便菌群。
[0041] 可使用其他的冷冻保护剂，例如右旋糖、甜菜碱、甘氨酸、蔗糖、聚乙烯醇、 Pluronic F-127、甘露醇、Tween-80、乙二醇、1,3-丙二醇、羟丙基纤维素、甘油、PEG/甘油混 合物、牛奶(例如，脱脂奶）、和丙二醇。
[0042] 在其他实施方式中，本公开的组合物的菌群的存活率可通过将菌群（和/或滤液 和/或细菌疗法组合物)在拟杆菌胆盐七叶苷琼脂(BBE)平板(从Becton&Di ckinson公司购 得，产品编号221836，BBL ?拟杆菌胆盐七叶苷琼脂BBE平板）、或者疾病控制中心(CDC)平板 (从86(^〇11&0丨〇1^118〇11公司购得，产品编号221733,881*0)(：厌氧菌5%绵羊血琼脂平板）、 或者这两者中进行培养而确定。至少在一些实施方式中，可以通过在1〇_ 5的系列稀释下存在 大约30CFU至大约300CFU菌落形成单位(CFU)计数、或者在KT6的系列稀释下存在大约30CFU 至大约300CFU的CFU计数，而确定本公开组合物在BBE平板和/或CDC平板上的菌群存活率。 还提供其中菌群的浓度为大约IO 7微生物/ml的菌群恢复治疗组合物。此外，用于生产菌群 恢复治疗组合物的方法还可包括进行前供体筛选和后供体筛选的步骤，人粪便样品在两次 筛选之间米集。
[0043] 除了确定微生物的存活率外，平皿测试也可以确定所存在活微生物的多样性。所 存在微生物的混合物或者微生物的多样性是人粪便样品质量和由该样品所制造的菌群恢 复治疗产品质量的另一个衡量尺度。CDC平板