一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]脑肿瘤是指原发性和转移性肿瘤的异质群体，中枢神经系统是危及生命的疾病，其特点是存活率极低。据统计，脑癌的发病率为40/10万，就全身肿瘤的发病率而论，脑瘤居第五(6.31%)，仅低于胃，子宫，乳腺，食道肿瘤。虽然该病的发病率不算最高，但是致死率非常尚Ο
[0003]目前的研究显示，恶性脑肿瘤治疗方法包括手术切除、放疗、和化疗及复合疗法。这些方法可以极大的延长患者的生存时间，虽然大部分治疗手段可以患者缓解病情，延长生存期，但传统治疗的风险高、毒副作用大并存在并发症，癌症对药物的抵抗导致治疗效果差，而治疗后产生的癌症耐药、复发和转移则是患者死亡的主要原因。因此，尽管在脑肿瘤的诊断和治疗方法上已经付出了极大的努力，但是脑肿瘤的治愈仍然是神经肿瘤的一大挑战，其最主要原因之一就是血脑屏障(Blood Brain Barrier)，血脑屏障为了维持脑部神经系统的稳定性，因此选择性允许某些物质通过，不允许另一些物质通过，从而阻止内生的有害物质和外来物质随血液流入，但同时这也成为脑肿瘤治疗的主要限制因素；同时，血脑屏障具有特殊的酶系统，这种酶系统不但可以使透过的药物迅速代谢失活，并且还具有高特异性的外排机制。由于血脑屏障的存在，一般的抗癌药物无法通过血液运输进入相应的肿瘤部位，即使有些药物可透过血脑屏障，但是会被特殊的酶系统外排到血液中，降低药效。所以普通的治疗药物难以对脑癌具体部位的细胞的杀伤起很大的作用，因此寻找能通过的血脑屏障并能靶向治疗的抗癌药物尤为重要。
[0004]另外，国内外有文献报道，藻蓝蛋白对肝癌细胞等具有直接的杀伤与抑制作用。同时，阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，该品抗瘤谱较广，目前已证实可适用于急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。但是这些药物均不能克服血脑屏障的问题而应用于脑癌的治疗领域。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有脑癌治疗技术和药物的不足，提供一种新型的脑癌治疗药物材料，本发明选取可降解聚乳酸共聚物修饰藻蓝蛋白，增加其亲水性自组装形成胶束作为运药载体，并包裹装载药物阿霉素，应用于抗肿瘤研究。
[0006]本发明的目的是提供一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束。
[0007]本发明另一目的是提供上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束的制备方法。
[0008]本发明的再一目的是提供上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束的应用。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，是以藻蓝蛋白和聚乳酸共聚物为原料，利用羧基的加成反应和亲疏水自组装原理，形成藻蓝蛋白-聚乳酸空载胶束，该空载胶束通过自组装的机理将阿霉素包裹在空载胶束里面，自组装形成胶束制备得到。
[0010]其中，优选地，所述藻蓝蛋白:聚乳酸共聚物:阿霉素的质量比为900?1100: 800?
1000:lo
[0011]更优选地，所述藻蓝蛋白:聚乳酸共聚物:阿霉素的质量比为:950?1050:900?950:1。
[0012]最优选地，所述藻蓝蛋白:聚乳酸共聚物:阿霉素的质量比为1000:920:1。
[0013]另外，优选地，所述羧基的加成反应的条件为室温下搅拌8?15小时。
[0014]优选地，所述聚乳酸共聚物为可降解的聚乳酸共聚物pla3600-peg200-pla3600。
[0015]具体地，上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束的制备方法，包括如下步骤:
51.按照藻蓝蛋白:盐酸阿霉素:聚乳酸共聚物=900?1100: 800?1000: 1的质量比，先向藻蓝蛋白溶液中加入盐酸阿霉素，搅拌均匀后，再加入聚乳酸共聚物溶液，室温下搅拌8?15小时；
52.取步骤S1处理后的溶液在超纯水中透析20?30小时，期间每隔5?7小时换一次水，以保证将反应的残物全部除去，透析结束后加入戊二醛进行交联，再用透析袋在超纯水中透析20?30小时，期间每隔5?7小时换一次水，透析结束后即得到藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，命名为PC-D0X-PLEL。
[0016]优选地，步骤S1所述室温为15?35°C。
[0017]优选地，所述藻蓝蛋白:聚乳酸共聚物:阿霉素的质量比为:950?1050:900?950:
Ιο
[0018]更优选地，所述藻蓝蛋白:聚乳酸共聚物:阿霉素的质量比为1000:920:1。
[0019]优选地，步骤S1所述藻蓝蛋白溶液的溶剂为ρΗ=7.4的PBS。
[0020]优选地，步骤S1所述藻蓝蛋白溶液的浓度为5mg/mLo[0021 ]优选地，步骤S1所述盐酸阿霉素的浓度为lmg/ml。
[0022]优选地，步骤S1所述搅拌均勾所用的时间为30min。
[0023]优选地，步骤S1所述聚乳酸共聚物溶液的溶剂为DMS0。
[0024]优选地，步骤S1所述聚乳酸共聚物溶液的浓度为25mg/ml。
[0025]优选地，步骤S1所述聚乳酸共聚物为pla3600-peg2000-pla3600。
[0026]优选地，步骤S1室温下搅拌的时间为12小时。
[0027]优选地，步骤S2所述透析是用悬浮式透析袋在超纯水中透析。
[0028]优选地，步骤S2所述透析的时间均为24小时。
[0029]优选地，步骤S2所述透析期间，均为每隔6小时换一次水。
[0030]另外，根据上述述制备方法制备得到的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，也应在本发明的保护范围之内。
[0031]本发明首次利用藻蓝蛋白和聚乳酸制备出胶束载体，将阿霉素包裹其中形成藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，成功制得一种抗脑癌的新型药物，该药物粒径很小(30?40nm)，符合穿过血脑屏障的要求，并对脑癌细胞具有一定的抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。
[0032]因此，上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束在制备抗脑癌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0033]本发明将藻蓝蛋白和阿霉素，用聚乳酸共聚物(pla3600-peg200-pla3600)混匀，自组装成胶束，用戊二醛交联，形成了目的PC-D0X-PLEL胶束;通过粒径分布、Zeta电位、红外光谱分析、SDS-PAGE电泳透射电镜以及体外释放动力学等方面表征胶束粒子粒径大小、形态容貌等;最后探究合成的胶束在细胞水平的抗脑癌作用，通过台盼蓝染色、细胞计数以及流式细胞仪检测细胞凋亡等实验，证明了 PC-D0X-PLEL胶束对脑癌细胞具有杀伤作用。
[0034]本发明为了克服血脑屏障对药物治疗效果的影响和限制，选择了纳米颗粒材料作为载体材料，本发明选择高分子聚乳酸共聚物(pla3600-peg200-pla3600)来修饰藻蓝蛋白，由于聚乳酸共聚物自身良好的生物可降解性和生物兼容性，其作为药物载体可以有效地提高藻蓝蛋白的稳定性。而结合高分子的藻蓝蛋白不仅可以保持藻蓝蛋白蛋白原有的性质，而且增加了其两亲性使其可以具有自组装的特性。从而使得藻蓝蛋白克服了蛋白本身一些缺陷(藻蓝蛋白具有很好的生物相容性，但本身存在容易降解、结构容易被破坏等缺陷)，更符合通过血脑屏障的药物载体的要求，并且降低了细胞毒性和其他对正常组织细胞的副作用，为靶向治疗脑癌提高更好的运载体，为无副作用治疗脑癌提供可能性。因此可降解高分子化合物修饰蛋白质是一种拓宽并提高蛋白质性能的有效性。
[0035]研究中藻蓝蛋白也具有很好的生物相容性和可降解性，使得其成为抗癌药物载体的合适选择;但本身存在的容易降解等缺陷。而两亲性嵌段共聚物可以改变藻蓝蛋白的亲水性和疏水性，使其在溶液中自组装形成胶束，从而改善藻蓝蛋白的稳定性。同时聚乳酸共聚物(pla3600-peg200-pla3600)修饰藻蓝蛋白，运用自组装的原理合成胶束，提供高效的药物运载体的基础上，也简化了药物载体合成的工艺流程，为临床药物试验提供良好的合成前提。
[0036]本发明最终成功的合成了分散性好，尺寸很小的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束；用该胶束作用脑癌体外细胞模型