一种鸡干扰素冻干剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种冻干剂的制备方法，特别是一种鸡干扰素冻干剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡干扰素是研究最早的动物干扰素之一，20世纪80年代就有鸡干扰素的相关报 道。已发现的鸡干扰素包括INF-a、e、O、S和INF-丫，现在已完成基因克隆、测序和定位。近 年来，对鸡干扰素的诱导条件和理化活性有了进一步的研究，同时对鸡白细胞干扰素进行 了大量的临床试验。研究表明，它对鸡的许多病毒性传染病如流行性腹泻、鸡攝、传染性胃 肠炎等，W及对牛病毒性腹泻、小碟攝、黑羊腹泻等都具有显著疗效，试验证实鸡干扰素与 牛羊等动物之间存在交叉活性。目前尚未有一种高效的用于治疗鸡病毒病的干扰素制剂。 现有的鸡干扰素必须每天重复用药，价格昂贵，治疗效果欠佳。今后的发展趋势是寻找一种 高效价格低廉的长效干扰素制剂，能够用于临床，对人而言，主要用作免疫增强剂和无毒副 作用，动物主要用于病毒病的治疗。目前尚未有鸡的长效干扰素投放市场。我们拟通过基因 修饰建立鸡长效干扰素，研制一种有效的制剂，3-5年投放市场。
[0003] 干扰素（IFN)是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病 毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分，鸡干扰素是治疗鸡病毒性疾病的 首选药物。鸡是现代农业发展的主要项目，发展养鸡生产是关系国计民生的大问题。困扰养 鸡业发展的主要问题是疾病问题，而鸡的传染性疾病是对鸡的最大危害，我国每年因鸡的 传染性疾病造成的经济损失达数十亿元，严重阻碍养鸡业的发展。在鸡的传染病中病毒性 疾病占主导地位，约占85 %。对于鸡的病毒性传染病(如鸡攝、口蹄疫、鸡繁殖与呼吸综合征 等）目前主要靠疫苗进行预防。鸡病毒性疾病绝大多数都有可用的疫苗进行预防。
[0004] 近年来，随着鸡病毒新毒株、变异株的不断出现，我国鸡病毒病的防治面临严峻的 挑战，目前的预防和治疗措施已经不能有效地控制疫病的发展，其危害日益严重，因此迫切 需要一种有效的防治措施和高效的药物。对动物的病毒性传染病的治疗只有依靠高免血清 或病毒干扰制剂。由于受价格和动物适应性的影响，目前尚无可供的高免血清用于鸡病毒 性疾病的治疗。虽然已经研究出可W用于治疗病毒性疾病的干扰素制剂，如聚肌胞、鸡干扰 素等，但运些产品存在严重缺陷，运类药品半衰期短、疗效差、价格高。对患病动物每天必须 重复用药，增加了用药的成本，往往达不到预期效果，使运类药物的应用受到严重的制约。 到目前为止，还没有一种有效而实用的药物用于鸡病毒性疾病的治疗，所W研制高效的抗 病毒药物是治疗鸡病毒性疾病的重要手段，是防治鸡病毒性传染病发展养鸡生产所必须。
【发明内容】
[000引本发明的发明目的在于:针对上述存在的问题，提供一种制备长效的鸡病毒干扰 素制剂，10天注射一次，对鸡病毒性疾病具有良好效果的鸡干扰素冻干剂的制备方法。
[0006]本发明采用的技术方案如下： 本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，包括W下步骤， 步骤一:无菌采集健康鸡鲜血，于l〇°C的条件下离屯、20min，吸取中间层白细胞，用质量 分数为0.85%NH4C1洗涂两次后离屯、，收集沉淀白细胞，除去NH4C1，按照白细胞:培养液体 积比1:15加入含5 %鸡血清的Eagle'S MEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10 X 1〇7 个/ml~25 X IO7个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液； 步骤二:取一份鸡白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的鸡白细胞干扰素，置于37°C 水浴摇床揽拌培养36h; 步骤S:按照每毫升鸡白细胞悬液50HA NDV n的加入量，在细胞悬液中加入一定量新 城疫病毒NDVE，调节抑为7.2,在水浴恒溫振荡器37°C旋转培养2地，培养完成后，用6M HCl 把培养液的pH调至3.5，在4°C下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的化OH溶液把pH调至 7.2，离屯、去除沉淀，取上清液，制得鸡白细胞干扰素粗制液； 步骤四：取一份鸡白细胞干扰素粗制液，用化OH溶液调节抑值到8.5，在冰浴条件下，按 照干扰素粗制液:聚乙二醇醋摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇醋，聚乙二醇醋加入量为五 份，升溫至4°C，揽拌反应化，向溶液中加入五份聚乙二醇醋，升溫至12°C，揽拌反应化，向溶 液中加入五份聚乙二醇醋，升溫至25°C，揽拌反应化，向溶液加入五份聚乙二醇醋，升溫至 36°C，揽拌反应化，完全反应后，加入0.75M的半脫甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇醋修饰 的干扰素； 由于采用了上述技术方案，采用聚乙二醇醋对干扰素进行修饰，能够扩大干扰素分子 的分子大小，使得干扰素不易经过肾脏代谢而排出体外，从而延长了干扰素在鸡体内的存 在时间；同时能够提高干扰素的稳定性，延长半衰期，降低免疫原性，提高干扰素的水溶性。
[0007] 步骤五:取一份聚乙二醇醋修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二 醇醋修饰的干扰素:烷基下二酸醋横酸钢摩尔比1:1向溶液中加入烷基下二酸醋横酸钢，用 盐酸调节抑为2.6，按照烷基下二酸醋横酸钢:a-氯基丙締酸下醋摩尔比1: 2.5向溶液中加 入a-氯基丙締酸下醋，揽拌IOmin，再用NaO的周节溶液的抑为5.8，继续揽拌反应，用0.祉m微 孔滤膜除去大的纳米球，得纳米球乳状胶体溶液； 由于采用了上述技术方案，将干扰素 Wa-氯基丙締酸下醋为载体，制备成为纳米球粒 径，能够成团祀向给药；同时有具有良好的分散性，在到达祀点后能够分散作用，提高干扰 素的药效作用力。
[0008] 步骤六:取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持溫度 在3.2~3.9°C的条件下，按照纳米球乳状胶体:渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条 件下加入渗透性保护液，继续在次声波条件下振荡30~45s，将溶液置于真空度0.98的环境 下，设置溫度为-12°C，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻化后， 将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置溫度为-20°C，按照120Pa/min的速度恢复气压 至常压，得到鸡干扰素冻干剂。
[0009] 由于采用了上述技术方案，溫度在3.9°C的条件下DMSO对细胞毒性最小，但是溫度 过低，冻存液中可能形成小冰晶，从而对细胞造成机械损伤，因此将溫度控制在3.2~3.9°C。
[0010] 在次声波振荡条件下，可W将冷冻保护剂迅速扩散开，渗透入乳状胶体的内部，将 干扰素分子完全置于在冷冻保护剂中。
[0011] 在真空状态下，经过预冻存后投入液氮中，阻隔空气热交换，提高冷冻效率，能够 迅速降溫，提高冻存脱水的效率，从而避免在冷冻过程中出现小冰晶，使得干扰素直接形成 玻璃体，提高了冻存的存活率，实现活性无损冻干。
[0012] 本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，所述渗透性保护液由3%~3.8%的DMSO， 4.8%~5.6%的明胶，0.6%~1.0%的单糖，2.8%~3.2%的半脫甘氨酸，1.8%~2.4%的人血清白蛋 白，1.4%~2.0%的吐溫-800，0.5%~0.7%的化Cl，4.9%~5.1%的甘露，20%~34%的乙酸乙醋和 44.2%~58. 的去离子水组成。
[0013] 由于采用了上述技术方案，人血清白蛋白是一种良好的冻干剂保护液，但是采用 人血清蛋白作为保护液成本过高，因此配制渗透性保护液用其他组分来代替大部分人血清 蛋白能够大大降低成本。
[0014]采胁%~3.8%的DMSO配制成为渗透性保护液，在渗透保护细胞活性的同时，将保护 剂的细胞毒性降低到最小，减小了在冷冻过程中保护剂对冻存干扰素造成的细胞毒性损 伤。
[0015] 单糖不仅可W为细胞代谢提供一定的营养，同时可W作为非渗透性保护剂，保证 降低了渗透性保护剂含量，对冻存效果不会造成影响。
[0016] 生理盐水降低了保护剂的渗透压，减小了在冻存过程中引起保护剂的渗透性损 伤。
[0017] 本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，所述渗透性保护液由3.4%的DMS0， 5.2%的明胶，0.8%的单糖，3%的半脫甘氨酸，2.1%的人血清白蛋白，1.7%的吐溫-800，0.6%的 NaCl，5%的甘露，27%的乙酸乙醋和51. 的去离子水组成。
[0018] 由于采用了上述技术方案，该比例为最佳值。
[0019] 本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和 0.5%~0.7%的果糖。
[0020] 本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，所述次声波的频率为8~13化。
[0021 ]由于采用了上述技术方案，该频率与内脏器官震动频