合成用于绿脓杆菌疫苗的低聚糖的制作方法
【专利说明】合成用于绿賊杆菌疫苗的低聚糖
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求享有2013年7月3日提交的美国临时专利申请号为61/842,474的权益， 该专利的全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
[0003] 本发明设及免疫原性和免疫保护的组合物W及用于制备和使用同源合成的绿脈 杆菌脂多糖(P.aeruginosa IipooligosaccharideKLOS)-基的低聚糖，共辆物及其衍生的 抗体的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了合成的低聚糖Ia或者化：
[0006]其中每个Ri和R2各自独立地为H、一种单醋或者一种寡糖，X是H、一种连接基团、或 者一种保护基团；L是一种连接基团并且Y是一种载体。在某些实施方案中，Ri和R2每个独立 地为H、a-加a-、a-Glca-2)-a-化a-、(6-QuiNAca-3)-a-化a-、(6-FucNAca-3)-a-化a-、a-化日[2，3，4-OAc ] -、0-如iNAc (1 -3)-日-化 a [ 2，4-OAc ]-、或者P-FucNAc (1 -3) -a-化a [ 2，4，-OAc]-。在某些实施方案中，Ri和R2选自在下表中所述的组合：
[000引本发明还包括组合物，其含有一种抗原Ia和/或化W及一种药物学可接受的载体。 优选地组合物含有一种单一抗原或者一种公知的、定义的抗原混合物。
[0009] 本发明进一步提供了疫苗组合物，包括免疫原性和免疫保护的组合物，包括抗原 Ia和/或化W及一种药学上可接受的载体。运些疫苗组合物可任选地包括一种药学上可接 受的佐剂。优选地，所述疫苗组合物是无内毒素的。所述的疫苗组合物可W是一、二、=、或 者四价。
[0010] 本发明进一步提供了一种用于人工合成低聚糖Ia和抗原化。
[0011 ]本发明进一步提供了用于诊断、治疗和预防由P. aeruginosa引起的感染。 具体实施方案
[0012] 定义
[0013] 为了提供一种对说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，提供了一下术语的定 义。
[0014] 单位、前缀和符号可W它们的SI形式表示。在运里所限定的数字范围包括限定范 围的边界数，并且包括所限定范围内的所有数。除非另有说明，术语"一个(a)"或者"一个 (an)"可W解释为"至少其中一个"的意义加W理解。在此所使用的段落标题仅用于组织的 目的，而不理解为多所述的主题的限定。在本申请中所引用的所有的文献，或者文献的部 分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍W及论文，其所有或部分作为参考均完整的通 过引用结合到本文中。
[0015] 正如在运里所使用的，"低聚糖"设及一种化合物，其含有两个或多个单糖单元。低 聚糖被认为是具有还原端W及非还原端，无论是否在还原端上的所述单糖单元实际上是一 种还原糖。根据本领域所接受的术语，低聚糖在运里所指出的是具有在左侧的非还原端W 及在右侧的还原端。在运里所描述的低聚糖是用针对非还原单糖(例如，Gal)的命名或者缩 写进行描述的，加上糖巧键(a或者e)、换件、在减重所设及的还原单糖的换位置的结构的前 缀，并且之后是所述还原单糖(例如，GlcNAc)的名称或者缩写。在两种糖之间的连接键可W 表示为，例如，2，3、2^3、或者2-3。每种单糖是化喃糖或者巧喃糖。
[0016] 正如在运里所使用的，"单糖"或者"单糖单元"设及在低聚糖中的单个的糖残基， 包括其衍生物。在上下文的低聚糖中，各单体单元是单糖，其是(或者可W是)通过径基基团 连接到另一个单糖上。
[0017] 正如在运里所使用的，"无内毒素"指的是一种不含有通常存在于分离的细菌糖类 或者多糖类中的内毒素或者内毒素成分的低聚糖。
[0018] 正如在运里所使用的，"合成物"指的是一种材料，其基本上或者大体上不含有一 些成分，例如内毒素、糖脂类、不相关的低聚糖等等，当其被分离时其通常伴随有一种化合 物。典型的，合成的化合物有至少大约90%的纯度，通常为至少大约95%，并且优选为至少 大约99%的纯度。纯度可W用本领域所熟知的多种方式进行测定。优选地，纯度是通过HPLC 进行测定。合成的材料的标识是通过质朴分析和/或NMR波谱法进行确定。
[0019]正如在运里所使用的，术语"连接物"指的是键或者基团，根据本发明所述，其表现 出在末端进入到与载体的反应功能基团共价连接的种类，例如，氨基、硫醇或者簇基基团， 并且在另一个末端同样地一种能够进入到与低聚糖的径基或者氨基基团共价连接的种类。 在运里的连接分子的两个功能基团之间是合适长度的生物相容性桥接分子，例如取代或者 未被取代的杂烷基、芳烷基、締控基、亚締基或者(寡)亚烷基二醇基团。连接物优选包括一 种取代的或者未被取代的（Ci-CiO)亚烷基基团或者一种取代的或者未被取代的（C2-C10)亚 締基基团。
[0020] 正如在运里所使用的，术语"载体"指的是蛋白质、肤、脂质、聚合物、树枝状聚合 物、病毒颗粒、病毒类似物颗粒(VLP)，或者它们的组合，其被连接到低聚糖上从而将所得到 的低聚糖-载体共辆物的免疫原性增强至比单独的低聚糖更高的水平。
[0021] 正如在运里所使用的，"蛋白质载体"指的是一种蛋白质、肤或其片段，其被连接或 者共辆到低聚糖上从而将所得到的低聚糖-蛋白质载体共辆物的免疫原性增强至比单独的 低聚糖更高的水平。例如，当使用一种载体时，蛋白质载体可起到T-依赖抗原的作用，所述 T-依赖抗原能够激活并且召集T细胞从而由此增强T细胞依赖性的抗体产生。
[0022] 正如在运里所使用的，"共辆"指的是一种化学交联，不论是共价的还是非共价的， 其最接近地将低聚糖与一种载体相关联从而所述低聚糖共辆物具有相对于非共辆的低聚 糖而言增强的免疫原性。
[0023] 正如在运里所使用的，"共辆物"值得是通过键和/或交联剂与一种载体化学结合 的低聚糖。
[0024] 正如在运里所使用的，"被动免疫"指的是将抗体给药于受试者，其中所述抗体是 在不同的受试者中产生的(包括相同或者不同种类的受试者），从而所述抗体附着在细菌表 面上，并造成细胞被吞隧。
[0025] 正如在运里所使用的，"保护性免疫"指的是给药于动物的疫苗或者免疫接种程序 表，诱导一种免疫应答，从而预防、阻碍疾病的严重程度的发展，或者降低疾病的严重程度， 所述疾病是由病原体引起的，或者减少或完全消除疾病的症状。保护性免疫也可W在合适 的动物攻击模型中基于血清抗体被预测用于激活补体介导的杀菌活性或者给予被动保护 抵抗细菌感染。
[00%]正如在运里所使用的，"免疫保护性组合物"指的是一种制备用于在宿主中提供保 护性免疫的组合物。
[0027] 正如在运里所使用的，-种足W诱发免疫应答的量"或者-种刺激免疫应 答的有效剂量"（例如，为了存在于制剂中的表位)指的是在给药一种具体的抗原制剂之前 W及在给药一种具体的抗原制剂之后测量的免疫应答指示之间具有一种可检测的差异。免 疫应答指示包括，但不限于:抗体滴度或特异性，如通过一种分析所检测到的，例如酶联免 疫分析法化LISA)、细菌测定（例如，用于测定血清杀菌抗体）、流式细胞仪、免疫沉淀、 Ouchter-Lowry免疫扩散;例如光点、蛋白质印记或者抗原阵列的结合检测测试;细胞毒性 测试等等。
[0028] 正如在运里所使用的，"抗体"包含多可龙和单克隆抗体制剂，W及与抗体的母体 分子显示免疫结合性质的包括杂交抗体、改造抗体、F(ab'） 2片段、F(ab)分子、Fv片段、在隧 菌体上显示的单链可变片段(SCFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、人源化抗体、及其功能性片 段。
[0029] 正如在运里所使用的，"单克隆抗体"指的是一种具有基本同质的抗体群体的抗体 组合物。所述术语并不受气制备的方式限制。该术语涵盖完整的免疫球蛋白分子，W及与抗 体的母体分子显示免疫结合性质的F(ab'） 2片段、F(ab)分子、Fv片段、在隧菌体上显示的单 链可变片段(scFv)、W及其他分子。
[0030]正如在运里所使用的，"特异性结合抗体"或者"特异性免疫反应"，当设及一种低 聚糖、蛋白质或肤时，指的是一种连接反应，其是基于和/或是在样品中存在抗原的证明，其 还可能包括其他分子的特异性群体。因此，在设定的免疫测定条件下，特定的抗体(或者抗 体)结合在样品中的特定的抗原（或抗原）上，并且不会W-种显著的量与存在于样品中的 其他分子结合。在运种条件下雨抗体的特异性结合可能要根据其对特定抗原(或抗原）的特 异性来选择的抗体或者抗血清。
[0031 ]正如在运里所使用的，"抗原"指的是可W被抗体分子特异性结合的任何物质。
[0032] 正如在运里所使用的，"免疫原"和"免疫原性组合物"指的是抗原组合物，其能够 启动淋己细胞活化从而导致抗原-特异性免疫应答。
[0033] 正如在运里所使用的，"表位"设及针对其特异性B细胞和/或T小应答的抗原上的 位点。所述术语页可W与"抗原决定簇"或者"抗原决定位点"互换使用。在蛋白质、低聚糖或 者其他生物聚合物上的B细胞表位位点可W由来自大分子的不同部分的基团组成，所述大 分子通过折叠聚集在一起。运种类型的表位被称为构想的或者非连续的表位，因为该位点 是由聚合物的片段构成的，其在线性序列中是不连续的，但是在折叠构象中时连续的。有生 物聚合物或其他分子的单个片段构成的位点被称为连续或线性位点。T细胞位点通常被限 制为线性肤。在一个简单的免疫测定中可W鉴定出识别相同表位的抗体，表明一种抗体阻 断另一种抗体与祀体抗原结合的能力。
[0034] 术语Ac指的是乙酷(-C(O)CHs)。
[0035] 术语TBS指的是叔下基二甲基娃。
[0036] 术语Troc指的是2，2，2-S氯乙氧基幾基。
[0037] 术语TC巧旨的是S氯乙酷亚氨酸醋。
[0038] 术语化th指的是领苯二甲酯基。
[0039] 术语TFA指的是S氣醋酸盐。
[0040] 术语TCA指的是S氯醋酸盐。
[0041] 术语Cbz指的是节氧幾基。
[0042] 术语化指的是苯甲酯。
[0043] 术语化指的是苄基。
[0044] 术语TES指的是S乙基甲娃烷基。
[0045] 术语TBDI^指的是叔-下基二苯基甲娃烷基。
[0046] 术语MCA指的是单氣醋酸钢。
[0047] 术语Lev指的是乙酷丙酷基。
[004引术语ADMB指的是4-0-乙酷基2，2二甲基下酸醋。
[0049]术语Tr指的是S苯甲基。
[(K)加]术语DM巧旨的是二甲氧S苯甲基。
[0051] 术语FMO巧旨的是9-巧基甲基碳酸盐。
[0052] 术语Alloc指的是締丙基氧幾基。
[0化3] 术语Nap指的是糞基。
[0化4] 术语沈t指的是甲硫基乙基。
[0055] 术语S化指的是苯硫基。