一种基于miRNA-34a小分子调节剂的递送系统及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，尤其涉及纳米载体材料在肿瘤治疗中的应用，具体涉及一种基于miRNA-34a小分子调节剂的纳米递送系统及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]癌症是严重危害人类生命健康的重大疾病，近年来发病率持续上升，死亡率不断增加。原发性肝癌，简称肝癌，其症状一般多不明显，特别是在病程早期。症状一旦出现，说明肿瘤已经较大，其病势凋亡进展则很迅速，通常在数周内即呈现恶病质，往往在几个月至I年内即衰竭死亡。常规的治疗肝癌的化疗药物有5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇等，在治疗的同时往往伴随严重的毒副作用。因此，研究安全、有效的抗肿瘤药物制剂对于肝癌的治疗具有重大意义。
[0003]RNA干扰(RNA interference,RNAi)被公认为是细胞调节基因表达的关键机制，先后在植物和哺乳动物细胞中发现。RNA干扰包括短的双链或单链寡核苷酸，通过特定的途径抑制基因表达，包括低等和高等生物体细胞中内源性的micr0RNA(miRNA)、人工合成的小干扰RNA(SiRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸(ASOS)和Piwi蛋白与siRNA的复合物(Piw1-1nteracting RNAs,piRNAs)等。
[0004]MicroRNA(miRNA)是在许多真核生物中发现的一类内源性的长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA。目前，大约发现了2000多种miRNA，它在进化上具有保守性，在表达和功能上具有多样性。最初发现miRNA在基因表达调控中起一定的作用，近年来发现它与肿瘤有关，它与癌症的发生、诊断、治疗和预后密切相关，在各类癌症中均发现了它的作用。它的主要功能是调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达。已有大量的科学研究表明，miRNA在肿瘤的发生、发展、转移、侵袭、预后等多种过程中发挥着重要作用。某些miRNA在肿瘤细胞中特异性高表达，其升高可以刺激肿瘤发生，这些miRNA扮演了癌基因角色，使用反义核苷酸技术，能够降低致癌miRNA表达水平，起到抑癌作用。某些miRNA在肿瘤细胞中特异性低表达，这些miRNA属于抑癌基因，增加该类miRNA的表达，能够起到抑癌作用。
[0005]MiRNA-34 家族包含 3 个 miRNAs，分别是 miRNA-34a、miRNA-34b 和 miRNA-34c。研究表明，miRNA-34a能够靶向调控多种细胞周期相关蛋白或蛋白激酶的表达，通过多种靶分子如CDK4/6、CDK2、E2F3、Fra-l、Notchl、SIRTl、Bcl-2等在肿瘤细胞增殖、周期和凋亡中发挥重要的调控作用，发挥抑癌功能。因此，恢复miRNA-34a的功能被视为一条治疗肿瘤的有效途径。目前恢复miRNA-34a的功能可以有多种途径，主要包括转染miRNA-34a模拟物以及使用小分子化合物调节miRNA-34a的表达。核酸类miRNA模拟物的转染效率低、易降解，限制了其在肿瘤治疗中的应用。miRNA小分子调节剂是近年来发现的一类小分子，其能够调控miRNA的表达。2，-羟基-2，4，4’，5，6’_五甲氧基查尔酮，又名Rubone，是一种疏水性的miRNA_34a小分子调节剂，能够上调miRNA-34a的表达，进而恢复miRNA-34a对肿瘤的抑制作用。但是由于该分子的疏水性质，并不能直接使用，使其治疗作用受到限制。
[0006]为了解决疏水性小分子化合物溶解性能，纳米递送系统成为近年来研究的热点和重点。开发出能够有效负载的递送系统，递送相关分子进入肿瘤组织和肿瘤细胞，具有重要的临床转化意义。
【发明内容】
[0007]为解决上述问题，本发明通过制备羧甲基葡聚糖修饰的聚乙烯亚胺-聚己内酯纳米颗粒，实现了疏水性miRNA_34a小分子调节剂Rubone的包载与递送；
[0008]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]所述的纳米递送载体为羧甲基葡聚糖修饰的聚乙烯亚胺-聚己内酯纳米胶束。本发明提供的纳米胶束，能够较高效率地包载miRNA-34a小分子调节剂Rubone，解决Rubone水溶性差的问题，改善其溶解性能。
[0010]本发明中，所述的两亲性聚合物材料为聚乙烯亚胺-聚己内酯共聚物，其中聚乙烯亚胺的分子量为800Da，聚己内酯分子量为20KDa。
[0011]本发明中，所述羧甲基葡聚糖为水溶性羧甲基修饰的葡聚糖衍生物，是生物相容性好、生物可降解和代谢的天然高分子材料，其取代度>50%，分子量为20-110KDa。羧甲基葡聚糖修饰的纳米胶束能够显示出更好的生物相容性，同时能够避免血浆中负电性蛋白的吸附，实现纳米胶束的长循环。
[0012]本发明中，所述聚合物胶束负载的活性成分为可以调节miRNA_34a表达的小分子调节剂Rubone，分子量为374.39的疏水性小分子化合物。
[0013]本发明中，miRNA-34a小分子调节剂与两亲性嵌段共聚物的质量比为1: 5?1: 20，优选为1:20。
[OOM]本发明中，羧甲基葡聚糖修饰的纳米胶束包载Rubone的制备方法，包括以下步骤:
(1)将miRNA-34a小分子调节剂和聚乙烯亚胺-聚己内酯两亲性嵌段共聚物溶于有机溶剂中，制得有机相；
(2)将含有乳化剂的水相加入到上述有机相中，涡旋，然后超声制得水相和有机相的混合物；
(3)将水相和有机相的混合物用旋转蒸发仪除去有机溶剂；
(4)将除去有机溶剂的溶液离心，即得负载Rubone的聚乙烯亚胺-聚己内酯聚合物胶束沉淀；
(5)沉淀用分散溶液复溶，即得负载Rubone的聚乙烯亚胺-聚己内酯聚合物胶束溶液；将最终得到的胶束溶液冻干、称量，计算产量;重新将产物溶解于超纯水中，制备成lmg/mL的水溶液；
(6)用pH= 7.4磷酸盐缓冲溶液制备10mg/mL的羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μηι的微孔滤膜；
(7)将ImL上述(5)中分散胶束溶液，滴加到ImL、10mg/mL的羧甲基葡聚糖水溶液中，使用磁力搅拌器持续搅拌30min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载Rubone的羧甲基葡聚糖修饰的聚乙稀亚胺-聚己内酯胶束。
[0015]其中，步骤(I)中，所用有机溶剂选自氯仿、甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷，上述溶剂可单独或者混合使用;本发明所述有机溶剂优选氯仿。
[0016]步骤(2)中，加入2mL?6mL、0.5%?2%乳化剂，涡旋5s?60s秒，超声Imin?1min分钟。
[0017]步骤(3)中，通过旋转蒸发仪旋蒸1min?30min除去有机溶剂。
[0018]步骤(4)中，离心机转速为8000rpm?12000rpm，离心时间5min?30min。
[0019]步骤(5)中，所用分散溶液为去离子水或磷酸盐缓冲溶液。
[0020]本发明所用试剂盒原料均市售可得;对于本发明中没有具体描述的装置、条件(温度、时间等)、物质、用量、方法等，均可采用本领域已知的或本领域技术人员按照常规技术可确定的。
[0021]本发明的再一个目的是提供所述聚合物胶束制剂在治疗肝癌中的应用。体外细胞水平验证了包裹Rubone的纳米递送系统能够显著抑制肝癌细胞HepG-2的增殖。进一步通过裸鼠肝癌肿瘤移植模型验证了尾静脉注射该纳米胶束，能够显著抑制肝癌的生长。
[0022]本发明的包载Rubone的羧甲基葡聚糖修饰的聚乙烯亚胺-聚己内酯纳米胶束具有以下优点:
[0023]1.选用的两亲性嵌段共聚物聚合物材料无毒，在体内可生物降解和代谢，具有良好的生物相容性;选用的羧甲基葡聚糖具有很好的生物相容性和生物可降解性，并且带负电性，能够显著抵抗血浆中负电性蛋白的吸附，提高尾静脉系统给药过程中血浆中纳米胶束的稳定性