制备高效的新型自体dc疫苗的试剂盒、方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备高效的新型自体DC疫苗的试剂盒、 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 世界卫生组织下属的国际癌症研究机构发表的《2014年世界癌症报告》指出，全球 癌症患者数量正以惊人的速度增加。2012年，全球新增癌症病例估计约达1400万例，预计20 年内这个数字将上升到2200万。同期癌症死亡人数也将从每年820万飙升至1300万。恶性肿 瘤目前主要治疗方法包括手术、放疗、化疗以及靶向治疗等。然而即使是采取了多学科综合 治疗的模式，癌症的死亡率仍然高居不下。新型的癌症治疗方式亟待发展。
[0003] 《SCIENCE》杂志将肿瘤的免疫治疗评为2013年度十大科学发现之首。树突状细胞 作为体内唯一已知可以激活静息T细胞能力的抗原呈递细胞(APC)，能通过MHCI分子-抗原 肽复合物和MHCII分子-抗原肽复合物的方式，激活相应的T淋巴细胞，发挥特异性免疫应答 抗肿瘤的作用。同时，DC也能通过释放白介素2(IL-2)、IFN-y (干扰素 γ )、IFN-a(干扰素 a)、激活自然杀伤细胞(NK)，发挥非特异性免疫抗肿瘤机制。DC在抗肿瘤免疫中的重要作 用，使得其成为免疫治疗中的热点之一。
[0004] 然而，肿瘤患者体内的DC，受到多种免疫抑制因素的影响，很难发挥其抗肿瘤作 用。免疫调控细胞(骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)等）、免疫负反馈调节 因子（白介素10(IL-10)、转化生长因子iKTGF-β)等）、免疫检测点(程序性死亡受体1及其配 体(PD-1/PD-L1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)等）均可通过多种途径降低DC诱导 的抗肿瘤功能。
[0005] 即使是在体外培养肿瘤患者骨髓、外周血单个核细胞(PBMCs)来源的DC，仍然受到 免疫抑制机制的影响。目前DC疫苗的制备方式，DC的前体细胞通过CD14单克隆抗体的免疫 磁珠分选或者单个核细胞贴壁获得，再采用以GM-CSF为基础(培养髓系DC，mDC)或FLT3-L (培养浆细胞样DC，pDC)的培养方式，等抗原负载后，利用TOLL样受体(TLR)激动剂刺激其成 熟。然而在肿瘤患者DC疫苗制备中，GM-CSF或FLT3-L均能促进DC前体细胞分化为MDSC。部分 TLR激动剂也能促进MDSC的生成，发挥免疫负反馈调节作用。MDSC可抑制DC的成熟，降低其 抗原呈递、迀移、诱导T细胞释放IFN-γ等功能。MDSC通过精氨酸酶-I (ARG-1 )、诱导性氮氧 化合物合成酶(iNOS)、活性氧簇(ROS)等抑制T细胞的增殖和活化，并能释放IL-HKTGF-β等 促进Treg细胞扩增。如何消除MDSC对DC疫苗的影响，成为是否能够制备高效DC疫苗的关键。
[0006] pDC在DC疫苗中的作用，也逐渐引起关注。未成熟pDC主要发挥诱导免疫耐受的作 用，成熟的PDC可通过释放大量的IFN-a，促进mDC成熟、诱导NK细胞活化，发挥抗原呈递作用 刺激CTL和Thl细胞产生抗肿瘤特异性免疫应答;如何发挥pDC的免疫刺激作用，亟需进一步 的研究。
[0007] 另外，程序性死亡受体(PD-I)及其配体(PD-Ll)在DC疫苗中的作用机制也逐渐得 到阐明。TLR的激活，一方面增强了DC的抗原呈递诱导T细胞特异性免疫应答的能力，同时也 导致了PD-Ll在DC的表达升高。PDL-I与表达在CTL、Thl细胞表面的I3D-I相结合，导致这些细 胞发生凋亡，负反馈抑制T细胞特异性免疫应答。在DC疫苗的制备过程中，阻断ro-1/PD-Ll 信号通路，对DC疫苗的抗肿瘤机制能否增强，也需要进一步探索。
[0008] 因此，有必要提供一种能够消除MDSC在DC疫苗制备中的负性调节作用、增强mDC或 PDC免疫刺激功能的高效的DC肿瘤疫苗。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种能够消除MDSC在DC疫苗制备中的负性调节 作用、增强mDC或pDC免疫刺激功能的能够制备高效的新型自体DC疫苗的试剂盒、方法及应 用。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
[0011] -方面，提供一种用于制备高效的新型自体DC疫苗的试剂盒，所述试剂盒包含如 下成分:GM-CSF、IL-4、FLT3-L和ATRA的细胞因子组合。
[0012] 本发明的试剂盒可以使用正常人来源的或者患者自体外周血、脐带血或骨髓等来 源的单个核细胞，进行贴壁培养，获得PBMCs的贴壁细胞，通过本发明的细胞因子组合诱导 生成未成熟DC，再采用混合TLRs激动剂促进DC成熟。本发明通过对现有GM-CSF+IL-4培养技 术进行改进，联合应用FLT3-L促进pDC生成，增加单个核细胞转化DC，同时利用全反式维甲 酸(ATRA)抑制MDSC生成，消除MDSC在DC疫苗制备中的负性调节作用，有效增强pDC免疫刺激 功能。
[0013] 进一步地，所述试剂盒还包括0K432和CPG ODN混合的TLRs激动剂。本发明还联合 TLRs(0K432+CPG 0DN)，促进DC(pDC、mDC)成熟，增加 DC迀移能力，增强其诱导CTL和THl等细 胞产生特异性免疫杀伤抗肿瘤的能力。
[0014] 优选地，所述试剂盒包含如下成分：500-1000U/ml GMCSF、500-1000U/ml IL-4、 50-200ng/ml FLT3-L和 1-5μΜ ATRA的细胞因子组合。
[0015] 优选地，所述试剂盒还包括0.1-5KE/ml 0Κ432和1-5μΜ CPG ODN混合的TLRs激动 剂；其中，所述CPG ODN为CPG 0DN21798、CPG 0DN2336、CPG 0DN2006或CPG 0DN2395的一种 或多种;所述CPG ODN优选为CPG 0DN21798。
[0016]另一方面，提供一种利用上述试剂盒制备高效的新型自体DC疫苗的方法，包括如 下步骤：
[0017] 1)单个核细胞的制备:无菌条件下，从外周血、脐带血或骨髓中获取单个核细胞， 再用生理盐水或Hanks液洗涤，1000 rpm离心10分钟，吸弃上清，沉淀即为PBMCs;
[0018] 2)DC前体细胞的制备：PBMCs在培养瓶中，37°C，5%⑶2条件下孵育1-2h，吸弃上 清，半贴壁的PBMCs即为包含DC前体细胞的细胞亚群；
[0019] 3)未成熟DC的培养：将半贴壁的PBMCs用GM-CSF+IL-4+FLT3-L+ATRA+自体血浆培 养的培养基培养获得未成熟DC。
[0020] 4)将获得未成熟DC进行抗原负载，利用0K432和CPG ODN混合的TLRs激动剂刺激 24h使DC成熟。
[0021] 其中，所述CPG ODN为CPG 0DN21798、CPG 0DN2336、CPG 0DN2006或CPG 0DN2395的 一种或多种;所述CPG ODN优选为CPG 0DN21798。
[0022]本发明的试剂盒可以使用正常人来源的或者患者自体外周血、脐带血或骨髓等来 源的单个核细胞，进行贴壁培养，获得PBMCs的贴壁细胞，通过本发明的细胞因子组合诱导 生成未成熟DC，再采用混合TLRs激动剂促进DC成熟。本发明通过对现有GM-CSF+IL-4培养技 术进行改进，联合应用FLT3-L促进pDC生成，增加单个核细胞转化DC，同时利用全反式维甲 酸(ATRA)抑制MDSC生成，消除MDSC在DC疫苗制备中的负性调节作用，有效增强pDC免疫刺激 功能;本发明还联合TLRs(0K432+CPG 0DN)，促进DC(pDC、mDC)成熟，增加 DC迀移能力，增强 其诱导CTL和THl等细胞产生特异性免疫杀伤抗肿瘤的能力。。
[0023] 优选地，所述TLRs激动剂为包括0.1-5KE/ml 0K432和1-5μΜ CPG ODN混合的TLRs 激动剂;或者，所述TLRs激动剂为包括0.1-5KE/ml 0Κ432和1-5μΜ CPG ODN混合的TLRs激动 剂，且所述0Κ432和CPG ODN混合的TLRs激动剂中还包括POLY(IC)、TNF-a、IFN- γ、其它类型 CPG ODN等的一种或多种。以0Κ432和CPG ODN二者联合应用的基础上，也可以添加其他刺激 物如POLY(IC)、TNF-a、IFN-γ其它类型CPG ODN等的联合应用。
[0024] 进一步地，所述步骤3中的培养基为包含500-1000U/ml GMCSF+500-1000U/ml IL-