一种还原敏感型多肽前药纳米胶束及其制备与应用
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及一种生物医药纳米材料制备，特别涉及一种多肽前药纳米胶束的制备方法。
(二)
【背景技术】
[0002]智能响应型载药系统在癌症治疗中越来越引起人们的关注。载药系统根据外界因素的变化如温度、PH和场效应等，自发做出响应，从而达到人们预期可控的治疗效果。
[0003]还原型谷胱甘肽(GSH)是动物细胞内含量最丰富的含有巯基的生物小分子，还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)是体内最主要的氧化还原对。在细胞内外不同的环境中GSH/GSSG的含量存在显著的差异。由于还原型辅酶II(NADPH)利谷胱甘肽还原酶的作用，细胞内GSH浓度是细胞外环境的100-1000倍，从而使细胞内环境保持较强的还原性。此外，研究发现，肿瘤组织中GSH浓度比正常组织至少高4倍，因此，比正常组织有更高的还原性。
[0004]多肽分子是基体内重要的一类生物活性物质。与蛋白质比较，具有分子量小，制备容易，抗原性弱，毒副作用小等优点，在医药研究和临床应用上越来越受到重视。由于小片段肽的低毒性、靶向性、无免疫原性、良好的生物相容性以及本身的治疗作用等特点，同时肿瘤细胞表面高表达肽类受体的发现，使得一些短肽可被作为导向物，以配体-受体特异性结合的方式应用于靶向药物递送系统。利用肽与其受体的特异性结合特性，将肽与药物结合形成复合物，增加药物在体内的选择性，减少药物的毒副作用，为提高药物的治疗提供了可能性，显示了良好的研究价值和应用前景。
[0005]点击化学(ClickChemistry)由化学家巴里?夏普莱斯在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色的分子的化学合成。叠氮与炔基的这类反应属于点击化学的范畴，其操作简单，条件温和，对氧气和水不敏感，反应具有立体选择性，反应效率高，副产物少，在生理条件下稳定。
[0006]药物载体的制备过程，通常较为复杂、繁琐，副产物较多而且很难除去。借助点击化学反应，可以实现简便而又高效的制备药物载体。在制备治疗癌症的前药过程中，采用Click反应可以快速高效的将两种不同性质的模块化分子结合起来。
(三)
【发明内容】
[0007]本发明目的是克服【背景技术】存在的问题和缺陷，提供一种制备还原敏感型多肽前药的方法，现有药物载体的制备过程，通常较为复杂、繁琐，副产物较多而且很难除去。本发明借助点击化学反应，可以实现简便而又高效的制备药物载体，即不同种类的药物分子与不同种类的多肽化合物通过叠氮与炔基的环化实现不同特性化合物的高效键合，以制备具有不同功能性的多妝如药。所制备的多妝如药具有环境刺激响应性，可以提尚治疗效率，降低治疗的毒副作用。
[0008]本发明采用的技术方案是:
[0009]本发明提供一种还原敏感型多肽前药纳米胶束，所述纳米胶束以疏水药物为内核，以细胞穿膜肽为壳层，所述内核与壳层通过还原敏感型双硫键连接;所述还原敏感型多肽前药纳米胶束结构通式为:K1Q-triaZOle-SS-D0X，K1Q为细胞穿膜肽序列，triazole为叠氮与炔基环化后的三唑五元环，DOX为疏水药物，SS为连接细胞穿膜肽序列与疏水药物的还原敏感型双硫键。
[0010]进一步，所述细胞穿膜肽由8?30个碱性氨基酸缩合而成，优选10个氨基酸。
[0011 ]进一步，所述氨基酸包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸，优选赖氨酸。
[0012]进一步，所述疏水药物包括阿霉素(DOX)、喜树碱或紫杉醇，优选阿霉素。
[0013]本发明还提供一种所述还原敏感型多肽前药纳米胶束的制备方法，所述方法为:
(I)DOX-SS-alkyne:将疏水药物溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中，加入三乙胺、二硫代酸酐，20°C?70°C搅拌0.lh?4h后(优选25°C搅拌反应22min)，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和丙炔胺，室温避光搅拌混匀，将混合液用去离子水沉淀，离心，沉淀干燥，得到DOX-SS-alkyne;所述疏水药物与二硫代二丙酸酐、三乙胺物质的量之比为1:0.5?1.5:1?1.2;所述疏水药物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和丙炔胺的物质的量之比为1:2?4: 2?4:4?6;所述二甲基甲酰胺体积用量以疏水药物物质的量计为100?130L/mol; (2)K1Q-triazole-SS-D0X:将步骤(I)制备的DOX-SS-alkyne和K10-N3加入二甲基甲酰胺中，在氮气保护下加入催化剂碘化亚铜，20°C?30°C反应完全后(优选25°C反应24h)，将反应液用0.005?0.020mol/L(优选0.013!1101/10乙二胺四乙酸二钠水溶液作为透析液进行透析(优选透析袋(1^(:0100Da)，通过乙二胺四乙酸二钠与过渡金属铜离子的络合作用，以除去铜离子)，取截留液冷冻干燥，得到还原敏感型多肽前药纳米胶束K1Q-triazole-SS-D0X;所述Kiq-N3为末端连接叠氮的细胞穿膜肽序列;所述DOX-SS-alkyne与Kiq-N3物质的量之比为1: 0.7?0.9;所述催化剂用量以DOX-SS-alkyne和Kiq-N3的物质的量之和计为I %-6% ;所述二甲基甲酰胺体积用量以DOX-SS-alkyne质量计为10?50ml/g ο
[0014]进一步，优选步骤(I)所述疏水药物与二硫代二丙酸酐、三乙胺物质的量之比为1:1?1.2:1?1.1 (最优选1:0.96:1.03);所述疏水药物与1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和丙炔胺的物质的量之比为I: 3?4: 3?4:4.5?5.5(最优选1:3.5:3.5:4.8)。
[0015]进一步，优选步骤(2)所述DOX-SS-alkyne与Kiq-N3物质的量之比为1: 0.8?0.9(最优选1:0.83);所述催化剂用量以DOX-SS-alkyne和Kiq-N3物质的量之和计为3%-5% (最优选 4.5%)0
[0016]进一步，优选步骤(2)所述Kiq-N3通过FMOC多肽方法合成:先合成侧链带有保护基的多肽序列，继而利用同样的方法加入氨基受FMOC保护之后的12-氨基十二酸，脱去12-氨基十二酸上的FMOC后，暴露出活性氨基，再加入叠氮乙酸，最后通过多肽固相合成方法合成Κ?Ο_Ν3，具体步骤是:
[0017](I)取树脂于DMF中，搅拌、静置溶胀，之后，抽干树脂并用DMF洗涤，所述DMF的用量以树脂质量计为12?16ml/g。
[0018](2)称取氨基受保护的赖氨酸FmOC-Lys(BOC)-0H、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于DMF，向树脂加入后搅拌，反应完成，抽干树脂并用DMF洗涤。所述树脂上活性点与Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIEA的物质量之比为1:0.6?0.8:0.012?0.015;01^的用量以树脂质量计为1ml?13ml/g。
[0019](3)向树脂中加入DMF、MeOH和DIEA的混合液，反应完成之后，抽干树脂并用DMF洗涤。完成对未反应活性Cl的封端。所述DMF的量以树脂质量计为4?10ml/g，Me0H的量以树脂质量计为2?5ml/g，DIEA的量以树脂质量计为0.06?1.5ml/g。
[0020](4)向树脂中加入哌啶、DMF的混合液，反应完成后，抽干树脂并用DMF洗涤。完成FMOC保护基的脱除。所述DMF的量以树脂质量计为2.5?10ml/g，哌啶的量以树脂质量计为15?22ml/g0
[0021 ] (5)固相合成下一个赖氨酸:配制Fmoc-Lys (Boc)-0H、O-苯并三氮卩坐-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、DIEA的DMF混合液。向树脂中加入混合液，搅拌反应之后，抽干树脂并用DMF洗涤。所述树脂上活性点与FmOC-Lys(BOC)-0H、HBTU、H0BT的物质量之比为1:3?5:7?9: 7?9 ;DIEA的量以树脂质量计为1.5?2ml/g，DMF的量以树脂质量计为2.5?10ml/go
[0022](6)茚三酮检测:取微量树脂与试管中，加入茚三酮甲醇溶液(茚三酮质量浓度1%?5%)，加热试管。如果茚三酮变成蓝紫色，则说明第